越来越多的研究证实，一氧化氮（nitric oxide, NO）在中枢神经系统的生理病理中起着重要的作 用。过量NO 与缺氧缺血脑损伤后的炎性反应、 兴奋性毒性以及神经元的死亡有关。诱导型一氧 化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS） 作为一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS） 家族中的一个亚型，在炎症、缺血等病理情况下 可以被细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或一 些细胞因子激活，诱导过量NO 产生^{[ 1 ]}。本文对 iNOS 的表达、过量NO 及次级产物活性氮（reactive nitrogen species,RNS）的产生、以及iNOS 抑制策 略与缺氧缺血脑损伤的关系综述如下，希望为缺 氧缺血脑损伤的治疗提供新的思路和方法。 1 NOS 概况

NO 在哺乳动物体内主要是通过3 种NOS 催 化生成，分别是神经元型一氧化氮合酶（Neuronal NOS,nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（Epithelial NOS,eNOS），以及诱导型一氧化氮合酶（Inducible NOS,iNOS）^{[ 2 ]}。3 种亚型NOS 都是二聚体，以L- 精氨酸作为底物，与氧分子以及还原型烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）一起共同作用，以黄素腺嘌呤 二核甘酸、黄素腺嘌呤单核苷酸、四氢生物嘌呤 作为辅酶产生NO^{[ 2 ]}。

在中枢神经系统中3 种亚型NOS 都有表达， 在大脑中以iNOS 和nNOS 的表达为主，其中iNOS 主要表达在巨噬细胞、小胶质细胞、神经元和星 型胶质细胞中，nNOS 则主要表达在神经元中，而 eNOS 在中枢神经系统的表达水平相对较低^{[ 3 ]}。 2 iNOS 的调节

iNOS 通常在病理情况下被诱导才会表达，并 且一旦表达就会产生大量NO，不受细胞内钙离子 浓度的调节^{[ 2 ]}，因此对iNOS 的调节的研究主要存 在于转录水平上。

诱导iNOS 表达的细胞外刺激物在小鼠和大鼠 中主要是LPS 以及一些细胞因子，如IFN-γ、IL- 1β、IL-6、TNF-α 等，而在人则更为复杂，常常 为IFN-γ、IL-1β、TNF-α 的复合物^{[ 4 ]}。

研究发现iNOS 基因的启动子区域存在与转 录基因的结合位点，这些转录因子包括核因子-κB （nuclear factor kappa B,NF-κB）、信号传导及 转录激活因子（signal transducers and activators of transcription,STAT）1α、干扰素转录调节因子 （interferon regulatory transcription factor,IRF）-1 等 都可以与iNOS 基因的启动子作用促进iNOS 基因 的转录^{[ 4 ]}。此外，缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF-1）的一个调节亚单位HIF-1α 也能与 iNOS 基因的启动子结合，促进iNOS 基因的转录^{[ 5 ]}。

调节iNOS 表达的信号通路比较复杂，不同的 诱导物在不同细胞中诱导iNOS 表达的信号通路都 可能不同，活化NF-κB 通路、Janus 激酶（Janusactivated kinase,JAK）/STAT 通路以及丝裂原激活 蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK） 通路都可以增加iNOS 的表达^{[ 4 ]}。

LPS 主要通过经典的NF-κB 通路诱导iNOS 表 达。LPS 通过与Toll 样受体结合，引起NF-κB 酶 抑制剂（IκB kinase,IKK）磷酸化，而活化的IKK 可以使NF-κB 的抑制剂磷酸化后失活，使NF-κB 释放，发生核转位，与核内iNOS 基因的启动子结 合位点相互作用，从而激活iNOS 的转录^{[ 6 ]}。

IFNγ 主要是通过活化JAK/STAT 通路诱导 iNOS 的表达。IFN-γ-JAKS-STAT-1α 这条通路已 经在小鼠、大鼠及人的细胞培养中被确认。STAT- 1α 则可以与iNOS 的启动子直接结合诱导iNOS 的表达或者是间接诱导IRF-1 的活性来诱导iNOS 的表达^{[ 4 ]}。最近的一项研究，一种名叫反应停的药 物可以通过减少iNOS 蛋白及mRNA 来抑制小鼠血 管内皮细胞中IFN-γ 诱导的NO 的产生，其机制 可能是抑制了IFR1、STAT1 的磷酸化从而减少了 iNOS 的表达^{[ 7 ]}。

近年在对神经系统变性疾病的研究中发现 MAPK 通路参与了iNOS 的调节。MAPK 家族包 括细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2），P38 和C-Jun 氨基末 端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK），它们都参 与了iNOS 表达的调节^{[ 8 ]}。研究发现异丙酚在胶质 细胞中可以增加JNK 和P38 的活性从而诱导iNOS 的表达以及NO 和活性氧物质（reactive oxygen species,ROS）的增加^{[ 9 ]}。

最近研究显示微小RNA（MicroRNA, miRNA）也可以调节iNOS 的表达。miRNA-155 以 TAK1 结合蛋白2 为结合位点来抑制iNOS 的基因 表达^{[ 10 ]}。在小鼠肾细胞癌细胞株中，发现miRNA -146a 可以抑制iNOS 的表达和NO 的产生，抑制 这种miRNA 时可恢复iNOS 的表达和NO 的产生^{[ 11 ]}， 进一步证实了miRNA 对iNOS 调节的抑制作用。 3 iNOS 在缺氧缺血脑损伤发生中的作用 3.1 iNOS 在缺氧缺血脑损伤中的表达

许多研究都提示缺氧缺血脑损伤时iNOS 的表 达出现在相对后期的阶段，在脑部浸润的中性粒细 胞中iNOS 的表达在缺血后12 h 开始出现，高峰出 现在缺血后48 h，缺血后7 d 又回到基准线^{[ 1 ]}。近 几年的研究发现缺血后24 h iNOS 表达明显增加^{[ 12 ]}， 甚至缺血再灌注后7 d 仍有iNOS 的表达和大量NO 的产生^{[ 13 ]}。

缺氧缺血脑损伤时，3 型NOS 均表达上调， 其中，iNOS 和nNOS 催化神经元产生过量NO， 诱导神经元凋亡；而eNOS 催化脑血管内皮细胞 生成NO，促进脑血管扩张，维持脑血流量，抑制 血小板和白细胞聚集和粘附，从而发挥神经保护 作用^{[ 14 ]}。nNOS 在缺氧缺血相对早期出现，呈现一 过性上调^{[ 15 ]}，而iNOS 的表达可能在脑缺氧缺血 相对后期的阶段参与迟发型的细胞损伤。研究提 示JNK1/2 的活化参与了脑缺血缺氧诱导的神经元 死亡，JNK1/2 有2 个表达高峰，分别在脑缺血后 30 min 和脑缺血后3 d，前者可以被nNOS 抑制剂 7NI 所抑制，而后者则被iNOS 的抑制剂AMT 所抑 制，这也提示nNOS 来源的NO 可能参与了JNK1/2 早期的活化导致神经元的损伤，而iNOS 来源的 NO 则参与了后期JNK1/2 的活化与后期神经元的 损伤有关^{[ 16 ]}。在小鼠的脑损伤模型中，也发现迟 发型的脑损伤与活化小胶质细胞中iNOS 来源的 NO 有关^{[ 17 ]}。 3.2 NO 在缺氧缺血脑损伤中的作用

许多研究都显示在一些病理情况下，例如脑 缺血时，活化的的小胶质细胞和胶质细胞中表达 的iNOS 会产生大量NO^{[ 8, 12, 18 ]}，iNOS 和nNOS 催化 神经元产生过量NO^{[ 19 ]}，而过量NO 是有神经毒性 的，这可能是iNOS 在缺氧缺血脑损伤中发挥损伤 作用的最重要的机制。过量NO 常通过以下机制在 缺氧缺血脑损伤中起毒性作用。

（1）产生RNS。最主要的就是过氧亚硝酸盐 （peroxynitrite,ONOO-）。ONOO- 主要由NO 和超 氧阴离子相互作用形成，它可以与多种细胞内组 分相互作用，这些细胞内组分包括一些线粒体蛋 白酶，如顺乌头酸酶，NADH 脱氢酶，和一些小 分子物质如DNA 和脂质。除此之外，ONOO- 还 能导致细胞内钙稳态的改变和促进线粒体膜通透 性的改变从而导致细胞的死亡^{[ 20 ]}。有研究在脑卒 中的模型中来源于nNOS 和iNOS 的NO 可以形成 ONOO-，它可以直接损伤线粒体酶和DNA^{[ 21 ]}。最 近的研究发现灵菌红素可以通过清除ONOO- 诱导 产生的蛋白的亚硝基化减轻大脑中动脉缺血再灌 注模型（middle cerebral artery occlusion /reperfusion, MCAO/R）诱导的脑损伤，提示ONOO- 在缺氧缺 血脑损伤中的重要作用^{[ 22 ]}。

（2）蛋白的S- 亚硝基化。所谓S- 亚硝基 化是指NO 共价结合到半胱氨酸硫醇基上^{[ 23 ]}。有 研究发现在神经元和脑组织中NO 可以使Src 同 源区2 的蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2） 发生S- 亚硝基化，形成SNO-SHP-2，在体内局部 脑缺血后SNO-SHP-2 的水平明显增加，SHP-2 的 S- 亚硝基化可以抑制其本身的磷酸化，阻断下游 神经保护通路ERK1/2 通路的活化，从而可以增 加N- 甲基-D- 天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）调节的兴奋性毒性，导致脑卒 中后的兴奋性毒性的损伤^{[ 23 ]}。此外，NO 还可以使 甘油醛-3- 磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH） 发生S- 亚硝基化而失 活，使它和核定位信号（nuclear localization signal, NLS）Siah1 结合，GAPDH-Siah1 蛋白复合体进入 核内，调节细胞死亡^{[ 24 ]}。

（3）其他机制。例如诱导细胞凋亡。在新生 小猪大脑的缺氧模型中，NO 可以诱导线粒体中促 凋亡蛋白Bax 表达的上调，导致促凋亡和抗凋亡 蛋白的比例增加，膜通透性的改变，钙离子内流， 最后线粒体DNA 断裂^{[ 25 ]}。过量NO 还可以调节自 噬通路，加重神经毒性。自噬是一个涉及蛋白质 降解和细胞器退化的过程^{[ 26 ]}，在神经元中自噬在 低氧环境下对活性氧物质和活性氮物质形成的蛋 白质损伤有保护作用。研究发现NO 可以通过一系 列的机制影响自噬体的形成，在体外大鼠的原代 皮质神经元培养予以缺氧再复氧的情况下，NO 可 以抑制自噬而促进神经损伤^{[ 18 ]}。 3.3 iNOS 在缺氧缺血脑损伤中的调节机制及抑 制策略

研究发现iNOS 是引起缺血性脑损伤进展的 一个重要因素，而且其主要作用在脑缺血的后期 （12~24 h），为治疗脑损伤提供了一个可能的时 间窗^{[ 27 ]}，探索缺氧缺血后iNOS 的调控机制及其抑 制策略成为目前的研究热点。

有研究拟通过抑制诱导刺激物降低iNOS 的表 达。研究用miRNA-181c 可以抑制缺氧缺血诱导的 脑损伤模型中TNF-α 的升高，从而抑制iNOS 的 升高和NO 产生的增加^{[ 13 ]}。还有研究发现IL-6 的 生物活性是在中枢神经系统缺血损伤中诱导iNOS 表达的一个病理因素，中和IL-6 的生物活性可以 减少iNOS 表达的上调，改善脑缺血损伤的远期康 复^{[ 28 ]}。

还有些研究则从抑制转录因子和iNOS 的结合 来抑制iNOS 的表达。例如在内毒素血症小鼠体内 运用Hsp70 可以阻止iNOS 的诱导和NO 的产生， 虽然没有研究在缺氧缺血脑病中作用，但是缺氧 缺血脑损伤会产生炎性反应，可能也会存在相应 的机制，需要进一步研究^{[ 6 ]}。IL-13 通过降低iNOS 上特异的IRF-1/ISRE 的结合来下调细胞因子诱导 的iNOS 的转录^{[ 29 ]}。抑制蛋白激酶C 的一个亚型 Δ 可以抑制IRF1 及STAT1 的活化，减少iNOS 的 表达^{[ 30 ]}。

更多研究主要在抑制iNOS 的信号通路上。在 小胶质细胞株BV-2 细胞的体外培养中，氧糖剥夺 模型（oxygen and glucose deprivation,OGD）和体内 实验小鼠的MCAO/R 模型在小胶质细胞和小鼠大 脑都产生大量的ROS，并且有蛋白的S- 亚硝基化 的明显增加，其原因主要是NADPH 氧化酶（NADPH oxidase,NOX2/gp91）的表达、iNOS 的表达增加， OGD 诱导的ROS 和NO 产生是通过gp91 活化 NF-κB 途径来上调了iNOS 的表达，而灵杆菌素则 是通过抑制NF-κB 的活化来降低iNOS 的表达^{[ 22 ]}。

尽管胰岛素及其受体都存在于中枢神经系统， 但是在脑中胰岛素是否作用于iNOS 通路一直没有 被肯定。最近一项研究发现，用LPS 刺激星型胶 质细胞可导致iNOS 表达上调；但若胰岛素先于 LPS 作用于星型胶质细胞，则会抑制iNOS 基因和 蛋白的表达，并且这种抑制有剂量相关性，其机 制可能是胰岛素可抑制LPS 诱导的IKB 磷酸化和 降解，通过抑制NF-κB 通路作用于iNOS 的表达^{[ 31 ]}。

在脑缺血时，各种转录因子如NF-κB 的激 活在调节氧化应激诱导的细胞损伤和缺血后炎性 反应中起着重要的作用，可以上调一些引起细胞 死亡的炎症基因和蛋白^{[ 32 ]}。HIF-1 的2 个靶基因 iNOS 和环氧酶都可以通过炎性反应诱导脑损伤^{[ 33 ]}。 iNOS 和（或）gp91 在小胶质细胞中表达都是依赖 NF-κB 和HIF-1α 信号途径^{[ 34 ]}。在缺氧缺血脑损 伤的模型中，CD36 是一种B 型的清道夫受体，在 NF-κB 的活化和缺血后的炎症中起着重要作用。研 究发现在不表达CD36 的小鼠MCAO 模型中NF-κB 活化和iNOS 表达都减弱，而且脑缺血所诱导的中 性粒细胞浸润和胶质细胞活化都被抑制了^{[ 35 ]}。

雌激素在中枢神经系统有保护作用。敲除 iNOS 基因的雌性小鼠在永久性MCAO 后梗死区域 明显减小，但是添加雌二醇没有进一步降低这种损 伤，而在野生型小鼠模型中雌二醇有神经保护作 用，这些结果显示iNOS 增加炎性反应的作用加重 了皮质和纹状体的卒中所致损伤，在切除卵巢用雌 二醇代替的雌性小鼠iNOS 的敲除也有神经保护作 用^{[ 36 ]}，这些结果提示雌激素的神经保护作用与转 录或转录后的调节机制减弱iNOS 的表达有关^{[ 37 ]}。 4 iNOS 的神经保护作用

也有研究认为iNOS 的表达在神经系统也有保 护作用，其机制可能与神经再生以及参与缺氧缺 血耐受有关。

一些研究提示大脑一些特定部位iNOS 表达 的增加可以诱导神经再生，有报道白血病抑制因 子可以诱导iNOS 的表达和增加NO 的水平，刺激 嗅觉前体神经细胞的增殖^{[ 38 ]}。还有研究发现iNOS 和其来源的NO 在放射状胶质细胞和星型胶质细 胞的成熟中起着重要的作用^{[ 39 ]}。而在缺血性损伤 中，有研究认为iNOS 以及iNOS 产生的NO 有利 于缺血诱导的神经损伤，该研究发现在暂时性缺 血的模型中iNOS 的表达增加了，用BrdU 标记的 新生神经元细胞也增加了，但是在敲除了iNOS 基 因的小鼠模型中则没有检测到新生的神经元^{[ 40 ]}。 进一步的研究也证实了缺血可以诱导海马区神经 元的再生，其机制是增加iNOS 的表达和NO 的产 生，使cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein,CREB） 的磷酸化增加， 而CREB 的磷酸化是NO 调节神经元生存的重要 环节^{[ 41 ]}。在暂时性全脑缺血后人参皂苷Rg1 可 以增加神经元的增生，其机制可能就是增加脑中 iNOS 的活性和NMDAR^{[ 42 ]}。

研究认为iNOS 的表达可以诱导缺血耐受，如 异氟烷在神经元的OGD 模型中起保护作用，其机 制是通过激活HIF-1α 增加iNOS mRNA 的水平， 而HIF-1α 活化部分是受Erk1/2 途径的调节的^{[ 43 ]}。 最近报道异氟烷在大鼠脑缺血后处理可以使HIF- 1α 和iNOS 的基因表达都扩增，而敲除HIF-1α 则减少iNOS 的表达，使脑组织对缺血不耐受^{[ 44 ]}。 除此之外，兴奋性毒性是一种被普遍认为参与缺 血脑损伤发生的机制，研究发现iNOS 来源的NO 形成的ONOO- 参与了诱导对兴奋性毒性的耐受， 与之前认为ONOO- 在缺血脑损伤中的主要是毒性 作用的研究也有不同^{[ 45 ]}。 5 结语

iNOS 作为NOS 家族中的诱导亚型，广泛存在 于中枢神经系统，在缺血等病理情况下可产生过 量NO。过量NO 有神经毒性，可加重缺血后的神 经炎性反应，诱导神经元的坏死、凋亡，参与许 多缺氧缺血脑损伤相关疾病的发生。抑制iNOS 的 表达及过量NO 产生在一些研究中取得了对缺氧缺 血脑损伤的保护作用，另有研究提示iNOS 在大脑 一些特定部位的表达也存在保护作用，但具体机 制还需要进一步的研究。