幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia,JMML）是临床罕见的儿童克 隆性造血干细胞异常性疾病，根据WHO 分型为 MDS/MPN。主要累及2 岁以下婴幼儿，其年发病 率为1.2/10⁶，占儿童白血病的2%~3%。男性多于 女性，男∶女比例为1.4~2.5 : 1^{[1, 2]}。JMML 临床表 现非特异性，遗传异质性较大，预后不良。研究 表明JMML 与多种突变基因引起RAS/ 促细胞分裂 原（mitogen）活化的蛋白激酶（MAPK）通路异 常有关^{[3, 4]}，然而目前尚无有关JMML 突变类型与 患儿临床特征及预后的相关性研究。为提高JMML 诊断水平，探讨突变基因类型与临床特征、预后 间的相关性，本研究回顾性分析我院2010 年10 月至2013 年3 月收治的14 例JMML 患儿临床病 例资料，并对JMML 基因突变类型及临床特征、 预后相关性进行初步探讨。 1 资料与方法 1.1 研究对象及诊断标准

选取2010 年10 月至2013 年3 月我院收治的 初诊为JMML 患儿14 例为研究对象，收集患儿的 临床资料进行回顾性分析。所有患儿均根据1997 年国际JMML 协作组诊断标准进行诊断：（1）临 床特征：①肝脾肿大，②淋巴结肿大，③贫血症 状及体征，④发热，⑤皮肤损害；（2）最低实验 室标准（同时满足以下3 个条件）：① Ph 染色体 或BCR/ABL 融合基因阴性，②外周血单核细胞计 数>1×10⁹/L，③骨髓原始细胞<20%；（3）明确 诊断要求的标准 （除了最低实验室标准至少满足 以下2 个条件）：①抗碱血红蛋白（HbF）随年 龄增加，②外周血涂片可见髓系幼稚细胞，③白 细胞>10×10⁹/L，④克隆性异常（包括单体7）， ⑤体外培养髓系细胞对粒细胞- 巨噬细胞集落刺 激因子（GM-CSF）高度敏感。 1.2 RT-PCR 检测JMML 突变基因

取各组晨起空腹外周血或行骨穿检查取骨髓 4~5 mL，EDTA 抗凝。按照基因组DNA 提取试剂 盒（北京博迈德生物技术有限公司）说明书进行基 因组DNA 提取。将提取的DNA 进行PCR 扩增。 本研究所选目的基因为JMML 常见突变基因，包 括PTPN11、N-RAS、K-RAS、CBL 和NF1，引物 由北京梓熙生物科技有限公司设计合成（表 1）。 PCR 反应体系为25 μL，包括DNA 样品1~2 μL， 2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH₂O 补足 至25 μL。PCR 扩增条件：94℃预变性5 min；94℃ 变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35 个 循环；72℃再延伸8 min。扩增产物于1.5% 琼脂糖 凝胶上进行电泳。取PCR 产物进行测序，测序结 果应用Mutation Surveyor v3.25 软件进行分析。

表 1(Table 1)

表 1 JMML 常见突变基因引物序列

表 1 常见突变基因引物序列

14 例JMML 患儿中，男11 例（79%），女 3 例（21%），男∶女为3.7 : 1；诊断时中位年龄 2.0 岁（ 范围0.6~6.0 岁）； 以白细胞增高为首 发症状的5 例，发热6 例，咳嗽3 例，面色苍白 3 例，皮肤黏膜出血点3 例，腹泻1 例。10 例患 儿初诊时出现浅表淋巴结肿大；11 例可见肝脏 肿大，平均右肋下3.2 cm（ 范围0.9~9.0 cm）； 9 例患儿脾脏肿大，平均左肋下3.6 cm（ 范围 1.3~9.0 cm）。Hb 8.6 g/dL（范围4.5~11.1 g/dL）， WBC 21.6×10⁹/L（ 范围10.4~41.5×10⁹/L），PLT 41.0×10⁹/L（范围9.0~191.0×10⁹/L），单核细胞 绝对值3.9×10⁹/L（ 范围1.0~12.0×10⁹/L），HbF 17.8%（ 范围1.0%~87.8%）。9 例患儿进行体外 GM-CSF 高敏感性实验，均呈阳性。13 例患儿行 染色体检查，5 例出现染色体数量或结构异常，其 中3 例为7 号染色体缺失，1 例为8 号染色三体， 1 例为复杂染色体核型异常。 2.2 JMML 突变基因检测结果分析

14 例患儿中，PTPN11 基因突变4 例（29%）， 为 Exon13 或Exon3 的点突变或错义突变；N-RAS 基因突变3 例（21%），为Exon2 点突变或Exon3 错义突变；1例患儿（7%）同时出现PTPN11和K-RAS 突变；6 例（43%）患儿未检测到常见突变。检测 到突变基因的8 例患儿基因测序图如图 1 所示。

图 1 8 例JMML 患儿突变基因DNA 测序图 A：患儿，男，3 岁，PTPN11 基因Exon13 点突变；B：患儿，男，2 岁， PTPN11 基因Exon3 点突变；C：患儿，男，2 岁，PTPN11 基因Exon3 错义突变；D：患儿，男，3 岁，PTPN11 基因Exon3 错 义突变；E：患儿，女，4 岁，N-RAS 基因Exon2 点突变；F：患儿，男，1 岁，N-RAS 基因Exon3 错义突变；G：患儿，男，1 岁，N-RAS 基因Exon2 点突变；H~I：患儿，男，3 岁，H 图示检测到PTPN11 基因Exon3 错义突变，I 图示检测到K-RAS 基因Exon2 错 义突变。箭头所示为基因具体突变位点。

本研究中PTPN11 基因突变最常见，发生该 突变的4 例患儿均为男性，中位年龄2.5 岁（范围 2.0~3.0 岁），从发病到明确诊断中位时间为1.0 个月（范围0.3~2.0 个月）；4 例患儿均表现不同 程度的贫血、出血、发热及肝、脾、淋巴结肿大； 外周血Hb 8.3 g/dL（ 范围45~133 g/dL），HbF 17.3%（范围5.1%~29.5%），WBC 计数31×10⁹/L （范围16.9~41.5×10⁹/L），单核细胞绝对值5.7× 10⁹/L（ 范围1.2~12.0×10⁹/L），PLT 计数24.7× 10⁹/L（范围13.0~41.0×10⁹/L）；其中3 例患儿进 行染色体及BCR/ABL 融合基因检测，结果显示融 合基因均为阴性，1 例出现7 号染色体缺失，2 例 染色体核型正常；临床观察发现PTPN11 基因突 变患儿疾病进展迅速，主要表现为高热，白细胞 进行性增高，肝脾肿大，感染症状明显，病程中 2 例患儿出现多浆膜腔积液，1 例患儿心功能衰竭； 随访至今，3 例患儿死亡，1 例疾病进展。发生N-RAS 基因突变的3 例患儿中，男2 例，女1 例，中位 年龄2.0 岁（范围1.0~4.0 岁），从发病到明确诊 断中位时间为13.7 个月（范围2.0~36.0 个月）； 2 例出现颜面或全身散在皮疹；外周血Hb 9.7 g/dL （ 范围7.5~11.1 g/dL），HbF 7.8%（ 范围1.4%~ 17.0%），WBC 计数 18.8×10⁹/L（ 范围12.3~28.5× 10⁹/L）；3 例患儿均进行染色体及BCR/ABL 融合 基因检测，结果显示融合基因均为阴性，1 例出现 复杂染色体核型异常伴有7 号染色体缺失，2 例染 色体核型正常，临床观察发现N-RAS 基因突变患 儿病情进展缓慢，随访至今，1 例患儿疾病未见 明显进展，2 例患儿死亡。K-RAS 合并PTPN11 基 因突变患儿为男性，3 岁，从发病到明确诊断中 位时间为3 个月；临床表现为贫血貌，可见浅表 淋巴结肿大，肝脾肋下2 cm，外周血WBC 计数 10×10⁹/L；此例患儿接受同胞相合造血干细胞移 植，随访至今血象正常。 3 讨论

JMML 是罕见的儿童克隆性造血干细胞异常 性疾病，多发生于婴幼儿，临床表现非特异性， 对化疗药物反应极差，预后不良，严重威胁着患 儿的健康。JMML 突变基因检测的开展，大大地提 高了临床诊断的准确率，探讨特殊突变基因类型 与临床特征之间的相关性对于提高临床诊断准确 率，判断疾病预后及选择有效治疗方案具有重要 的意义。目前研究表明JMML 发病与NF1、RAS、 PTPN11、CBL 突变引起的RAS/ 促细胞分裂原 （mitogen）活化的蛋白激酶（MAPK）通路异常有 关^{[3, 4, 5, 6]}，其中PTPN11 是JMML 最常见的突变基因， 大约35% 的JMML 患儿有PTPN11 体细胞突变^{[7, 8]}。 其主要编码非受体型酪氨酸磷酸酶蛋白SHP-2， 参与生长因子下游信号转导途径，调节多种细胞 反应，包括细胞增殖，分化及游走。在无症状性 JMML 患者体内PTPN11 突变常位于外显子3、4、 13^[9]，最常见的突变类型为226G>A，产生E76K 蛋白，其具有高度磷酸酶活性，可诱导胎儿肝脏 细胞对GM-CSF 具有高度敏感性，且可将BaF3 细 胞系转化为细胞因子非依赖型^{[8, 10, 11]}。本研究对 14 例患儿进行了JMML 常见突变基因检测，其中 4 例患儿出现PTPN11 突变，占29%，其中2 例患 儿突变位点为最常见的 226G>A 。

JMML 患者对化疗反应极差，异基因造血干 细胞移植是目前唯一有望治疗此类疾病的方法。 但是仍有40% 左右的患者移植后出现复发，且由 于造血干细胞来源有限以及免疫排斥反应，使大 部分患者失去异基因造血干细胞移植的机会。近 年来研究发现，部分JMML 患者有自发缓解趋势。 Matsuda 等^[12] 对临床进行观察报道3 例N-RAS 或 K-RAS 突变JMML 患儿临床病情进展缓慢，并获 得最终的自发缓解。Flotho 等长期观察发现12 例 明确诊断为JMML 患儿未进行造血干细胞移植， 随访3 年，5 例带有RAS 突变的患儿获得长期缓 解^[13]。研究发现能够获得自发缓解的JMML 病例 一般都具有好的预后因素：如发病年龄小，初诊 血小板>33×10⁹/L，HbF 减低^{[14, 15]}。还有研究报 道女性病例预后不良，可导致女性患儿总生存率 （OS），无事件生存率（EFS）明显减低^[16]。本 研究对14 例JMML 患儿进行突变基因检测，并对 突变类型及临床特征、预后进行相关性分析，研 究发现，PTPN11 突变为本研究中最常见的突变基 因类型，占总病例数的29%，与文献报道结果一 致^{[3, 4]}。3 例（21%）患儿出现N-RAS 突变，1 例（7%） 患儿同时伴有PTPN11 及K-RAS 突变。本研究 14 例病例中男性明显多于女性，男: 女为3.7 : 1， 尤其PTPN11 突变患儿均为男性，中位年龄2.5 岁， 高于RAS 及无突变基因患儿，PTPN11 患儿初诊 PLT 中位数为24.7×10⁹/L，而HbF 偏高，平均值 为17.3%，根据文献报道均为预后不良因素。临 床观察发现，此组病例中除1 例未进行临床相关 检测及治疗外，其余3 例病情进展迅速，短时间 内WBC 明显增高，肝脾进行性增大，进而出现多 浆膜腔积液，随访至今，3 例患儿均死亡，1 例患 儿病情进展，提示PTPN11 突变类型疾病凶险，病 情进展迅速，预后不良。N-RAS 突变组中位年龄 2.0 岁，PLT 中位数为35×10⁹/L，HbF 明显低于 PTPN11 突变患儿，此组病例病情进展缓慢，从发 病到明确诊断中位时间为13.7 个月。K-RAS 合并 PTPN11 突变患儿由于接受同胞供者造血干细胞移 植，目前病情恢复，血象正常，但由于此种复杂 突变类型病例数较少，基因类型与临床预后关系 仍有待于进一步观察。

PTPN11 是JMML 病例中最常见的突变类型， 此种类型外周血WBC 计数及单核细胞绝对值增高， PLT 明显降低，疾病进展迅速，预后不良，建议 诊断明确尽早行造血干细胞移植。N-RAS 突变病 例病情进展缓慢，部分病例疾病无进展，临床上 可动态观察，根据病情变化决定治疗方案。复杂 突变基因类型病例数极少，需增加病例数进一步 总结分析。