中国当代儿科杂志  2015, Vol. 17 Issue (1): 100-106   PDF    
骨髓间充质干细胞缺陷与获得性再生障碍性贫血
章婧嫽, 竺晓凡     
1. 中国医学科学院血液学研究所, 天津 300021;
2. 北京协和医学院血液病医院儿童血液病诊疗中心, 天津 300021
摘要:获得性再生障碍性贫血(AA)患者骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)缺陷已成为近年来研究的热点之一.该文对BM-MSCs 缺陷在AA 发病中的作用及其对AA 治疗的临床应用进行综述.越来越多的实验室证据证明了BM-MSCs 缺陷在AA 的发病中极有可能起着重要的作用,无论是其生物学特点、基因表达谱的缺陷,抑或是增殖分化能力、造血支持作用乃至免疫调节功能的耗竭,都成为在免疫失衡基础上促使AA 不断进展至难以恢复的重要节点.随着MSCs 研究的不断深化,将恢复骨髓造血微环境为主要目的的MSCs 输注可能成为AA 治疗的新模式.
关键词获得性再生障碍性贫血     骨髓间充质干细胞     缺陷    
Defectiveness of bone marrow mesenchymal stem cells in acquired aplastic anemia
ZHANG Jing-Liao, ZHU Xiao-Fan     
Diagnosis and Treatment Center of Pediatric Blood Diseases, Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Pecking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300021, China
Abstract: The defectiveness of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) in acquired aplastic anemia (AA) has been a frequent research topic in recent years. This review summarizes the defectiveness of BM-MSCs which is responsible for the mechanism of acquired AA and the prospective application of BM-MSCs in the treatment of acquired AA. An increasingly number of laboratory statistics has demonstrated that the defectiveness of BM-MSCs is more likely to play an important role in the pathogenesis of AA, namely, the apparently different biological characteristics and gene expression profiles, the decreased ability of supporting hematopoiesis as well as self-renewal and differentiation, and the exhaustion of regulating immune response of hematopoietic environment. Those abnormalities continuously prompt AA to become irreversible bone marrow failure along with the imbalanced immunity. With deepening research on MSCs, infusion of MSCs for the primary purpose of recovering hematopoietic microenvironment may become a new approach for the treatment of AA.
Key words: Acquired aplastic anemia     Bone marrow mesenchymal stem cell     Defectiveness    

获 得 性 再 生 障 碍 性 贫 血(acquired aplastic anemia,简称 AA)是一种免疫介导的以骨髓增生 减低及三系造血细胞减少、非造血细胞增多为特 征的骨髓造血功能衰竭综合征。近年研究表明, 异常的免疫细胞及分子介导的造血干细胞功能缺 陷及骨髓造血微环境异常是 AA 的微观表现[1, 2]。 异常免疫细胞通过分泌诸如IFN-γ、TNF-α和 ILs 等多种细胞因子直接或间接地破坏骨髓中的造 血干 / 祖细胞,同时抑制基质细胞产生早期造血生 长因子,使得骨髓正常造血受到抑制[3, 4, 5]。既往研 究表明,AA 患者的造血干细胞存在生物学特性异 常和功能的损伤,其CD34+细胞表达的与免疫应答、 凋亡、细胞周期及增殖相关的基因不同于正常人, 体外培养方法发现造血干细胞及髓系造血祖细胞 数量锐减,这可能是造血干细胞(HSC)过度凋亡 所致骨髓衰竭的重要机制之一[6, 7]

免疫异常是 AA 发病的主要病理机制[2, 7],而 异常的 T 细胞又是发病的重要因素,由 CD4+T 细 胞及 CD8+T 细胞介导的免疫应答造成了 AA 患者 的 HSC 损伤,这一过程包括激活的树突状细胞 (DCs)促进 Th1/Th2 失衡并激活更多的 CD8+T 细 胞、CD4+ CD25 +调节性T 细胞(Treg 细胞)活性 减低、异常的免疫细胞及间质细胞产生大量的诸 如 IFN-γ、TNF-α、MIP-1α 和 IL-2、-8、-12、 -15、-17、-23 等细胞因子构成细胞因子网络,从 而损伤造血干 / 祖细胞、血管内皮祖细胞以及间充 质干细胞。

然而越来越多的证据表明,包括骨髓间充质 干细胞(BM-MSCs)在内的骨髓基质细胞本身的 缺陷,极有可能是 AA 的另一病理机制。本文对 BM-MSCs 缺陷在 AA 发病中的作用进行综述。 1 AA 患者 BM-MSCs 生物学特性改变 1.1 AA 患者 BM-MSCs 的形态及免疫表型

通过正常对照和 AA 儿童的 BM-MSCs 研究发 现,患儿 BM-MSCs 前 3 代形态与对照组无显著性 差异,但患儿 BM-MSCs 较对照出现提前分化和老 化现象,且体外培养成功率低于对照组[8]。研究 表明 AA 患儿与正常对照 BM-MSCs 具有相同的免 疫表型,CD29、CD44 和 CD105 阳性,而 CD3、 CD19、CD34+ 和 CD45 等造血细胞的标记阴性,但 动态观察发现,随着培养时间延长,BM-MSCs 的 生长速度和增殖能力逐渐下降[9] 。正常 BM-MSCs 均可传至20 代以上,而AA 患儿BM-MSCs 传代 多在15 代以内。还有研究证实,虽然AA 患者 和健康对照组BM-MSCs 均表达 CD105、CD73、 CD90、CD29、CD44、CD49e、CD166 和 HLAABC,但不表达 CD34+、CD45 和 HLA-DR [10, 11]。通 过β-微管蛋白荧光标记后,在荧光共聚焦显微镜 下观察到 AA 患者的 BM-MSCs 纺锤形、漩涡状结 构比对照更为不规则且凌乱。 1.2 AA 患者 BM-MSCs 的基因表达谱异常

Li 等 [12] 对基因表达谱的筛查并通过实时定量 PCR 验证后发现 AA 患者 BM-MSCs 与正常对照相 比,有 314 个基因表达不同,其中 207 个基因表 达上调,107 个基因表达下调,这些基因大部分参 与了包括甾体激素的生物合成,脂肪细胞因子、 细胞粘附分子(CAM)、转化生长因子 β(TGF-β) 信号通路,细胞周期循环,造血干细胞系发育与 凋亡等在内的重要生物过程的信号通路。这与之 后所证实的 AA 患者 BM-MSCs 众多生物学特性异 常一致,提示异常的基因表达谱可能是 BM-MSCs 功能紊乱并造成骨髓造血微环境中干 / 祖细胞异常 增殖分化、凋亡增加、生物学特性改变的重要根 源之一。 2 AA 患者 BM-MSCs 细胞因子水平异常减 低造血支持作用

AA 发生骨髓衰竭的病理机制复杂,发病的主 要原因可能为造血干细胞数量减少或质量缺陷, 然而其内在机制仍有待研究。AA 患者造血干细胞 缺陷和骨髓微环境异常可能同时存在。虽然 MSCs 支持促进造血的机制尚不清楚,但是 MSCs 对骨髓 造血微环境的营养支持作用以及对促进骨髓造血 祖细胞植活的造血重建作用是已被多项研究证实 的[13, 14] 。研究发现 AA 患者 BM-MSCs 分泌 SCF 及 可溶性 c-kit 受体的含量低于正常人,推测 SCF 水 平的下降是 AA 发病的重要病理生理机制[15, 16]。 研究证实,SCF 水平下降后,其与配体 c-kit 结合 也会随之减少,SCF/c-kit 信号通路异常不仅影响 HSC 的增殖能力,同时还会降低其他的造血生长 因子的反应性,故而 SCF 减少极有可能影响造血 功能。由此推测骨髓造血衰竭的发生可能与此有 着密切的联系。但是 Kojima 等[17] 研究发现 AA 患 者血浆中可溶性SCF 水平与正常对照无显著差别。

刘双等[18] 检测 AA 治疗前后及正常人(对照 组)骨髓组织中血管内皮生长因子(VEGF)、碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达,发现治 疗前骨髓组织中 VEGF、bFGF 表达水平明显低于 对照组,缓解后 VEGF、bFGF 表达水平较治疗前 明显提高。作为骨髓组织中两种重要的促血管生 成因子,VEGF、bFGF 表达水平的变化与骨髓基 质损伤及恢复程度一致。

IL-6 的作用在于上调造血干细胞进入 G0 期, 促使 G0 期细胞进入增殖周期,从而促进造血干细 胞的分化和成熟。虽然作为一种重要的前炎症因 子 IL-6 在 AA 小鼠模型(放射与化疗药物构建) 中分泌水平较正常小鼠高[19] ,但AA患者BMMSCs lL-6 的表达明显低于正常对照组,进一步说 明AA患者BM-MSCs 在支持造血干细胞增殖和成 熟方面存在缺陷[20]

FGF2 作为发挥调节骨髓造血支持作用的重要 细胞因子,由相应受体通过旁分泌及自分泌信号 通路刺激基质细胞扩增并促进造血干细胞增殖[21]。 研究表明,AA 患儿 BM-MSCs FGF2 表达水平较正 常人低,因而推测 BM-MSCs 低水平的 FGF2 表达 极有可能参与 AA 的发病。Jiang 等[22] 将10名AA 患儿的 BM-MSCs 在体外进行分离培养并传代后利 用 RT-PCR 检测 BM-MSCs 中的 FGF2 mRNA 水平, 利用 Western blot 检测 FGF2 的蛋白表达水平并通 过 ELISA 验证细胞外液的 FGF2 水平发现,同正 常对照相比 AA 患儿 BM-MSCs 的 FGF2 基因表达 水平下降,但具体的体内实验尚未完成。

TPO 是体内促进巨核细胞系增殖、分化、成 熟的主要细胞因子,其含量主要受血小板及成熟 巨核细胞表面的血小板生成素受体总量的负调控, 杨诗梅等[16] 发现AA患者BM-MSCs TPO 表达明显 高于正常对照组,虽然患者 BM-MSCs 的 TPO 表 达增多,但其受体的减少可能导致了造血干细胞 增殖和分化功能的失调[2]。Liu 等[23] 对比非重型 再生障碍性贫血(NSAA)患者与正常志愿者 BMMSCs 分泌细胞因子时发现,患者的 BM-MSCs 表 达 TGF-β1、3 减少而 HGF 和 TGF-β3 的表达无 明显区别。AA 的疾病过程极可能是因失去了骨髓 基质细胞的造血支持作用而发展加重,说明 BMMSCs 等骨髓基质细胞的造血支持缺陷与 AA 的发 生、发展及预后密切相关。 3 AA 患者 BM-MSCs 增殖与分化潜能异常 3.1 AA 患者 BM-MSCs 自我更新与增殖能力下 降

黄永兰等[24]、Chao 等[25] 、El-Mahgoub 等 [26] 发现儿童 AA 的 BM-MSCs 存在增殖能力缺陷:就 增殖能力而言,AA 患儿的 BM-MSCs 比正常儿童 和胎儿 BM-MSCs 在培养早期并无明显区别,但将 增殖细胞群体扩增至 20 倍或者传代至第 5 代之后, 两者之间产生明显的差异,其中患儿 BM-MSCs 增 殖能力明显下降,而正常儿童和胎儿的 BM-MSCs 则可以稳定地扩增至 30 倍增殖;Jiang 等[22] 在研 究中通过对比增殖曲线发现,AA 患儿的 BM-MSCs 传代至第 8 代后其增殖能力较正常对照明显降低; 吴艳等[8] 将 AA 患儿体外扩增 1 周后的骨髓单个 核细胞进行集落培养,发现 BFU-E、CFU-GM 计数 显著低于正常对照组,这种支持造血功能的减低 可能与 AA 患儿 BM-MSCs 增殖能力的减低及分泌 SCFs 的减少有关;这些研究结果均提示儿童 AA 患者的 BM-MSCs 增殖能力下降。

成人AA患者BM-MSCs 增殖能力亦较正常人 弱,其传代一般不超过 15 代,程梅等[27] 通过对 AA 患者的 BM-MSCs 培养发现,AA 组 BM-MSCs 增殖能力显著低于对照组,细胞倍增时间高于对 照组。此外,Li 等[12] 在培养分离获取患者BMMSCs 并传代至第 3 代后,利用 BrdU-ELISA 方法 在第 0、2、4、6、8、10、12 天评估患者与正常 对照组 BM-MSCs 的增殖能力,并对培养传代的 MSCs 进行成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)分析, 结果同样发现 AA 患者的 BM-MSCs 增殖率明显低 于正常对照组,且体外 CFU-F 形成能力显著低于 对照组。研究者利用 Annexin V 凋亡检测试剂盒 对两组细胞的凋亡率进行检测后发现,AA 组 BMMSCs 凋亡细胞率(8.09%±3.32%)明显高于健康 对照组(5.00%±2.59%)。也有实验将 AA 患者 和正常对照组 BM-MSCs 进行体外培养,均发现不 同程度的 BM-MSCs 总量减少、增殖能力、自我更 新能力等的异常[28]

因而不难推论,AA 患者的 BM-MSCs 自我更 新及增殖能力低于正常人,更严重的是伴随着凋 亡率的增加,BM-MSCs 这类骨髓基质细胞数目锐 减,必然造成造血干细胞损伤易感性增加,因此 BM-MSCs 的这些变化极有可能加重 AA 的疾病进 展。 3.2 AA 患者 BM-MSCs 分化潜能异常

BM-MSCs 在骨髓微环境中可以分化为成骨细 胞和脂肪细胞,这是可以互相转化的两个可逆的 调节,而骨髓逐步脂肪化则是 AA 最主要的一个病 理特征。

岳寒等[29] 以脂蛋白脂酶(LPL)作为标志性 基因,应用 PCR 技术检测其作为晚期脂肪形成标 志在 AA 患者和正常人 BM-MSCs 中的表达差异, 发现 AA 患者的 BM-MSCs 在诱导脂肪形成的过程 中,早、中期(7 d、14 d)LPL 基因的表达较正常 人明显增高,晚期(21 d)表达亦增加。提示 AA 患者 BM-MSCs 有更强的易成脂性,影响造血干细 胞的增殖和分化,从而参与 AA 的发病。

程梅等[27] 分别用成骨诱导液及成脂肪诱导 液对 AA 患者和对照组的 BM-MSCs 进行培养,经 油红 O 及茜红素染色鉴定,发现 AA 患者的 BMMSCs 成脂肪细胞分化诱导率高于对照组(85% vs 60%,P<0.05),而成骨细胞分化诱导率低于对 照组(45% vs 65%,P<0.05);收集诱导后细胞 在转录水平分别检测相关基因表达情况后发现, AA 患者 BM-MSCs 成脂肪细胞相关基因 PPARγ mRNA、FABP4 mRNA 表达水平上调而成骨细胞相 关基因 ALP mRNA 和 BGLAP mRNA 的表达水平下 调;Tripathy 等[30] 通 过 RT-PCR 和 Western blot 分 析发现 AA 患者 BM-MSCs 脂联素和 FABP4 mRNA 及蛋白表达水平较正常对照高,而与成骨分化相 关的骨桥蛋白基因表达水平较对照组则无明显差 异;Li 等[12] 在筛查验证基因表达谱时亦发现 AA 患者 BM-MSCs 与成脂肪信号通路相关的细胞因 子表达水平较正常人上调;Xu 等[31] 研究发现 AA 患者的 BM-MSCs 较正常对照相比,对成脂分化 具有抑制作用的转录因子 GATA-2 表达降低,而 PPARγ 的表达则是明显上调的;El-Mahgoub 等 [26] 在儿童 AA 患者中亦发现类似的结果。以上这些研 究结果表明:AA 的 BM-MSCs 存在成脂肪细胞和 成骨细胞分化失衡。因为成骨细胞是造血干细胞 壁龛的重要组成细胞[32],造血干细胞伴随成骨细 胞同时增加或减少,成骨细胞的相对损失会导致 造血受损[33] ,因此推测 BM-MSCs 的分化潜能异常 有可能会促使 AA 患者成骨细胞相对减少,骨髓脂 肪化,进而引起造血干细胞壁龛减少,并最终导 致 AA 患者造血功能衰竭。 4 AA 患者 BM-MSCs 免疫调节功能紊乱 4.1 AA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞增殖活化 的影响

近年来有大量实验证明 AA 患者 BM-MSCs 对 淋巴细胞的增殖和活化的抑制作用减弱,使其成 为AA 发病的重要机制之一[11, 34]。Liu 等[23] 通过 PHA 刺激的 T 淋巴细胞增殖实验、混合淋巴细胞 培养(MLR)反应和 T 淋巴细胞周期检测比较正 常志愿者和 AA 患者两组 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞 的抑制作用发现,正常的 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞 增殖的抑制作用明显(均抑制至 1% 以下),而 AA 患者的 BM-MSCs 抑制增殖的能力存在明显缺 陷(抑制率仅仅为 61% 和 43%),且经免疫抑制 剂治疗后,抑制率仍无明显改变。PHA 刺激后的 T 淋巴细胞在加入正常志愿者 BM-MSCs 后,活化 的 T 淋巴细胞被阻滞在 G0/G1 期,更少进入 S 期, 而加入患者 BM-MSCs 后虽也能将 T 淋巴细胞阻滞 在 G0/G1 期,但这种能力相对较弱。Bacigalupo 等[35] 对重型再生障碍性贫血(SAA)患者与健康对照者 的 BM-MSCs 在混合淋巴细胞培养反应(MLR)、 PHA 刺激的 T 淋巴细胞增殖实验对比发现相似的 结果,并且这种缺陷在免疫抑制治疗后依然存在, 只有在骨髓移植后才可能恢复。来自于 SAA 和 NSAA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞的抑制作用存 在差异,后者的 BM-MSCs 对活化 T 淋巴细胞的抑 制作用的减弱不如前者显著,也许这能够用来说 明为什么 SAA 患者的造血功能更难以恢复。值得 注意的是,Xu 等[36] 在对比 34 个儿童 AA 患者与 正常对照来源的 BM-MSCs 在 PHA 刺激的 T 淋巴 细胞增殖实验中的反应后,并没有发现 Bacigalupo 所发现的差异,二者对剂量依赖性的 T 细胞增殖 抑制作用均存在且并没有明显的差异,两种不同 的观察结果除了可能由于样本量的差异外,亦不 排除儿童 AA 与成人 AA 发病机制可能存在差异性。 4.2 AA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞各亚群比 例及功能的作用

目前认为 AA 的重要发病机制是免疫异常, 即 CD8+ CTL 功能亢进,CD4 + Th1/Th2 失衡及 Treg 细胞数目减少及功能缺陷[37],多年的实验室研 究证据表明,正常的脐带来源的间充质干细胞 (hUC-MSCs)及 BM-MSCs 均具备对不同T 细胞 亚群的免疫调节功能,而与正常人相比,AA 患者 的 BM-MSCs 无论从质量还是数量都存在异常 [38, 39, 40, 41, 42], 因此有学者推测这样的异常极有可能会加重 AA 本 就失衡的免疫调节系统[11] ,BM-MSCs 固有的免疫 抑制作用的减低,必然会造成 CD8+CTL 功能亢进 及 Treg 细胞功能减低,T 淋巴细胞亚群的失衡而 致机体免疫紊乱,其中功能亢进的 CD8+CTL 可以 激活 Fas 凋亡途径,使得造血干 / 祖细胞大量凋亡。 虽然在临床上已经有通过输注第三方供者来源的 BM-MSCs 使部分 AA 患者获得缓解并脱离血制品 输注的病例报道[43, 44, 45, 46],然而这种治疗的作用机制 并不明确,不过可以肯定的是,AA 患者 BM-MSCs 数量减少及功能缺陷不仅可使其支持造血功能缺 陷,还会影响其对免疫细胞的抑制能力,致使体 内 T 淋巴细胞和 NK 细胞异常活化损伤造血细胞, 最终导致造血功能衰竭。

陈新等[10] 提取 hUC-MSCs 并在体外检测不同 浓度 hUC-MSCs 对 AA 患者 T 淋巴细胞的抑制率发 现,hUC-MSCs 能调整 AA 患者倒置的 CD4+ /CD8+ 比例,抑制 AA 患者造血负调控因子 IL-2、IFN-γ 分泌水平,且这种免疫调节作用依赖于 hUC-MSCs 的数量,这也在一定程度上从侧面反映了 AA 缺陷 的 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞的比例及功能的影响。 4.3 AA 患者 BM-MSCs 与 Treg 细胞

研究证实 AA 患者体内的 Treg 细胞水平较正 常人下降,而 Th17 细胞水平较正常人则是上升的, 这种比例在免疫抑制治疗成功后可以逐渐恢复正 常[47, 48, 49],而正常 MSCs 也能通过其免疫调节作用使 得 Treg 细胞数目扩增,其机制并非仅仅同传统的 免疫抑制治疗一样针对自身反应性 T 细胞群,Yan 等[50] 研究发现,MSC 不仅增加 Treg 细胞 IL-10、 TGF-β 的分泌,还可以上调 Treg 细胞 PD-1 的表 达,通过增强 PD-1/B7-H1 相互作用而放大 Treg 细 胞的免疫调节功能,也有研究者构建了人类胚胎 干细胞来源的 MSCs 诱导 Treg 细胞扩增的模型, 即 MSCs 分泌外泌体囊泡(exosomes),并通过 单核细胞表面 TLR 受体信号通路分泌细胞因子 IL-10 等,从而诱导 CD4+ T 淋巴细胞分化成为 Treg 细胞[51] 。但AA 患者缺陷的BM-MSCs 是否影响 Treg 细胞发挥免疫调节作用,以及 BM-MSCs 是否 能在治疗中与免疫抑制剂、骨髓生长因子等联合 使用治疗 AA,尚待进一步证实。

柴晔等[52] 将 hUC-MSCs 与 AA 患者外周血单 个核细胞以不同比例共培养,发现能增加 Foxp3 mRNA 相对表达量及 CD4+ CD25 + Foxp3 +Treg 细胞占 外周血 CD4+ T 细胞比例,且 hUC-MSCs 能增加 AA 患者 Treg 细胞数量,其可能的机制是通过细胞间 接触分泌可溶性细胞因子(TGF-β、HGF 等)诱 导 Treg 细胞产生。刘增慧等[53] 利用流式细胞仪检 测了 13 例 SAA、17 例慢性再生障碍性贫血(CAA) 及 10 例健康对照者外周血 CD4+ CD25 + Foxp3 + Treg 表达发现 AA 患者表达明显低于健康对照者;且 SAA 表达较 CAA 低;进一步对其中 7 例应用免 疫抑制治疗 1 年以上无效的 AA 患者进行亲缘供 者 BM-MSCs 静脉回输(剂量(1~10)×10 6 /kg, 1 次 / 周,4 周为 1 疗程),检测对比回输治疗前 后外周血 CD4+ CD25 + Foxp3 +Treg 表达发现,异体 BM-MSCs 治疗后 AA 患者外周血 CD4+ CD25 + Foxp3 + Treg 表达上调,这种上调作用在应用BM-MSCs 回输治疗第1 个疗程后即可出现,第2 个疗程 CD4+ CD25 + Foxp3 +Treg 细胞表达依然上升,最高时 可接近正常水平,总体上逐步趋于稳定,但维持 时间尚不确定。因此推测,MSCs 治疗有可能上调 AA 患者 CD4+ CD25 + Foxp3 +Treg 细胞的表达,而更 确切的临床结论则需要进一步更多临床病例的对 比研究以及更长的临床进程研究。MSCs 作为一种 强大的免疫调节细胞,可能有诱导机体产生 Treg 细胞以维持免疫耐受,发挥免疫抑制作用,这一 推测也为 AA 细胞治疗的进一步研究提供了理论依 据。

综上所述,尽管目前也有学者认为 AA 患者 的 BM-MSCs 与正常人相比,在表型、造血支持作 用乃至免疫应答及抗炎作用方面均没有明显的差 别[54] ,但越来越多的实验室证据证明了 BM-MSCs 缺陷在 AA 的发病中极有可能起着重要的作用,无 论是其生物学特点、基因表达谱的缺陷,抑或是 增殖分化能力、造血支持作用乃至免疫调节功能 的耗竭,都成为在免疫失衡基础上促使 AA 不断进 展至难以恢复的重要节点,随着 MSCs 研究的不断 深化,将恢复骨髓造血微环境为主要目的的 MSCs 输注可能成为 AA 治疗的新模式[55, 56, 57, 58]

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