获 得 性 再 生 障 碍 性 贫 血（acquired aplastic anemia，简称 AA）是一种免疫介导的以骨髓增生 减低及三系造血细胞减少、非造血细胞增多为特 征的骨髓造血功能衰竭综合征。近年研究表明， 异常的免疫细胞及分子介导的造血干细胞功能缺 陷及骨髓造血微环境异常是 AA 的微观表现^{[1, 2]}。 异常免疫细胞通过分泌诸如IFN-γ、TNF-α和 ILs 等多种细胞因子直接或间接地破坏骨髓中的造 血干 / 祖细胞，同时抑制基质细胞产生早期造血生 长因子，使得骨髓正常造血受到抑制^{[3, 4, 5]}。既往研 究表明，AA 患者的造血干细胞存在生物学特性异 常和功能的损伤，其CD34⁺细胞表达的与免疫应答、 凋亡、细胞周期及增殖相关的基因不同于正常人， 体外培养方法发现造血干细胞及髓系造血祖细胞 数量锐减，这可能是造血干细胞（HSC）过度凋亡 所致骨髓衰竭的重要机制之一^{[6, 7]}。

免疫异常是 AA 发病的主要病理机制^{[2, 7]}，而 异常的 T 细胞又是发病的重要因素，由 CD4⁺T 细 胞及 CD8⁺T 细胞介导的免疫应答造成了 AA 患者 的 HSC 损伤，这一过程包括激活的树突状细胞 （DCs）促进 Th1/Th2 失衡并激活更多的 CD8+T 细 胞、CD4⁺ CD25 ⁺调节性T 细胞（Treg 细胞）活性 减低、异常的免疫细胞及间质细胞产生大量的诸 如 IFN-γ、TNF-α、MIP-1α 和 IL-2、-8、-12、 -15、-17、-23 等细胞因子构成细胞因子网络，从 而损伤造血干 / 祖细胞、血管内皮祖细胞以及间充 质干细胞。

然而越来越多的证据表明，包括骨髓间充质 干细胞（BM-MSCs）在内的骨髓基质细胞本身的 缺陷，极有可能是 AA 的另一病理机制。本文对 BM-MSCs 缺陷在 AA 发病中的作用进行综述。 1　AA 患者 BM-MSCs 生物学特性改变 1.1　AA 患者 BM-MSCs 的形态及免疫表型

通过正常对照和 AA 儿童的 BM-MSCs 研究发 现，患儿 BM-MSCs 前 3 代形态与对照组无显著性 差异，但患儿 BM-MSCs 较对照出现提前分化和老 化现象，且体外培养成功率低于对照组^[8]。研究 表明 AA 患儿与正常对照 BM-MSCs 具有相同的免 疫表型，CD29、CD44 和 CD105 阳性，而 CD3、 CD19、CD34⁺ 和 CD45 等造血细胞的标记阴性，但 动态观察发现，随着培养时间延长，BM-MSCs 的 生长速度和增殖能力逐渐下降^[9] 。正常 BM-MSCs 均可传至20 代以上，而AA 患儿BM-MSCs 传代 多在15 代以内。还有研究证实，虽然AA 患者 和健康对照组BM-MSCs 均表达 CD105、CD73、 CD90、CD29、CD44、CD49e、CD166 和 HLAABC，但不表达 CD34⁺、CD45 和 HLA-DR ^{[10, 11]}。通 过β-微管蛋白荧光标记后，在荧光共聚焦显微镜 下观察到 AA 患者的 BM-MSCs 纺锤形、漩涡状结 构比对照更为不规则且凌乱。 1.2　AA 患者 BM-MSCs 的基因表达谱异常

Li 等 ^[12] 对基因表达谱的筛查并通过实时定量 PCR 验证后发现 AA 患者 BM-MSCs 与正常对照相 比，有 314 个基因表达不同，其中 207 个基因表 达上调，107 个基因表达下调，这些基因大部分参 与了包括甾体激素的生物合成，脂肪细胞因子、 细胞粘附分子（CAM）、转化生长因子 β（TGF-β） 信号通路，细胞周期循环，造血干细胞系发育与 凋亡等在内的重要生物过程的信号通路。这与之 后所证实的 AA 患者 BM-MSCs 众多生物学特性异 常一致，提示异常的基因表达谱可能是 BM-MSCs 功能紊乱并造成骨髓造血微环境中干 / 祖细胞异常 增殖分化、凋亡增加、生物学特性改变的重要根 源之一。 2　AA 患者 BM-MSCs 细胞因子水平异常减 低造血支持作用

AA 发生骨髓衰竭的病理机制复杂，发病的主 要原因可能为造血干细胞数量减少或质量缺陷， 然而其内在机制仍有待研究。AA 患者造血干细胞 缺陷和骨髓微环境异常可能同时存在。虽然 MSCs 支持促进造血的机制尚不清楚，但是 MSCs 对骨髓 造血微环境的营养支持作用以及对促进骨髓造血 祖细胞植活的造血重建作用是已被多项研究证实 的^{[13, 14]} 。研究发现 AA 患者 BM-MSCs 分泌 SCF 及 可溶性 c-kit 受体的含量低于正常人，推测 SCF 水 平的下降是 AA 发病的重要病理生理机制^{[15, 16]}。 研究证实，SCF 水平下降后，其与配体 c-kit 结合 也会随之减少，SCF/c-kit 信号通路异常不仅影响 HSC 的增殖能力，同时还会降低其他的造血生长 因子的反应性，故而 SCF 减少极有可能影响造血 功能。由此推测骨髓造血衰竭的发生可能与此有 着密切的联系。但是 Kojima 等^[17] 研究发现 AA 患 者血浆中可溶性SCF 水平与正常对照无显著差别。

刘双等^[18] 检测 AA 治疗前后及正常人（对照 组）骨髓组织中血管内皮生长因子（VEGF）、碱 性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，发现治 疗前骨髓组织中 VEGF、bFGF 表达水平明显低于 对照组，缓解后 VEGF、bFGF 表达水平较治疗前 明显提高。作为骨髓组织中两种重要的促血管生 成因子，VEGF、bFGF 表达水平的变化与骨髓基 质损伤及恢复程度一致。

IL-6 的作用在于上调造血干细胞进入 G0 期， 促使 G0 期细胞进入增殖周期，从而促进造血干细 胞的分化和成熟。虽然作为一种重要的前炎症因 子 IL-6 在 AA 小鼠模型（放射与化疗药物构建） 中分泌水平较正常小鼠高^[19] ，但AA患者BMMSCs lL-6 的表达明显低于正常对照组，进一步说 明AA患者BM-MSCs 在支持造血干细胞增殖和成 熟方面存在缺陷^[20]。

FGF2 作为发挥调节骨髓造血支持作用的重要 细胞因子，由相应受体通过旁分泌及自分泌信号 通路刺激基质细胞扩增并促进造血干细胞增殖^[21]。 研究表明，AA 患儿 BM-MSCs FGF2 表达水平较正 常人低，因而推测 BM-MSCs 低水平的 FGF2 表达 极有可能参与 AA 的发病。Jiang 等^[22] 将10名AA 患儿的 BM-MSCs 在体外进行分离培养并传代后利 用 RT-PCR 检测 BM-MSCs 中的 FGF2 mRNA 水平， 利用 Western blot 检测 FGF2 的蛋白表达水平并通 过 ELISA 验证细胞外液的 FGF2 水平发现，同正 常对照相比 AA 患儿 BM-MSCs 的 FGF2 基因表达 水平下降，但具体的体内实验尚未完成。

TPO 是体内促进巨核细胞系增殖、分化、成 熟的主要细胞因子，其含量主要受血小板及成熟 巨核细胞表面的血小板生成素受体总量的负调控， 杨诗梅等^[16] 发现AA患者BM-MSCs TPO 表达明显 高于正常对照组，虽然患者 BM-MSCs 的 TPO 表 达增多，但其受体的减少可能导致了造血干细胞 增殖和分化功能的失调^[2]。Liu 等^[23] 对比非重型 再生障碍性贫血（NSAA）患者与正常志愿者 BMMSCs 分泌细胞因子时发现，患者的 BM-MSCs 表 达 TGF-β1、3 减少而 HGF 和 TGF-β3 的表达无 明显区别。AA 的疾病过程极可能是因失去了骨髓 基质细胞的造血支持作用而发展加重，说明 BMMSCs 等骨髓基质细胞的造血支持缺陷与 AA 的发 生、发展及预后密切相关。 3　AA 患者 BM-MSCs 增殖与分化潜能异常 3.1　AA 患者 BM-MSCs 自我更新与增殖能力下 降

黄永兰等^[24]、Chao 等^[25] 、El-Mahgoub 等 ^[26] 发现儿童 AA 的 BM-MSCs 存在增殖能力缺陷：就 增殖能力而言，AA 患儿的 BM-MSCs 比正常儿童 和胎儿 BM-MSCs 在培养早期并无明显区别，但将 增殖细胞群体扩增至 20 倍或者传代至第 5 代之后， 两者之间产生明显的差异，其中患儿 BM-MSCs 增 殖能力明显下降，而正常儿童和胎儿的 BM-MSCs 则可以稳定地扩增至 30 倍增殖；Jiang 等^[22] 在研 究中通过对比增殖曲线发现，AA 患儿的 BM-MSCs 传代至第 8 代后其增殖能力较正常对照明显降低； 吴艳等^[8] 将 AA 患儿体外扩增 1 周后的骨髓单个 核细胞进行集落培养，发现 BFU-E、CFU-GM 计数 显著低于正常对照组，这种支持造血功能的减低 可能与 AA 患儿 BM-MSCs 增殖能力的减低及分泌 SCFs 的减少有关；这些研究结果均提示儿童 AA 患者的 BM-MSCs 增殖能力下降。

成人AA患者BM-MSCs 增殖能力亦较正常人 弱，其传代一般不超过 15 代，程梅等^[27] 通过对 AA 患者的 BM-MSCs 培养发现，AA 组 BM-MSCs 增殖能力显著低于对照组，细胞倍增时间高于对 照组。此外，Li 等^[12] 在培养分离获取患者BMMSCs 并传代至第 3 代后，利用 BrdU-ELISA 方法 在第 0、2、4、6、8、10、12 天评估患者与正常 对照组 BM-MSCs 的增殖能力，并对培养传代的 MSCs 进行成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）分析， 结果同样发现 AA 患者的 BM-MSCs 增殖率明显低 于正常对照组，且体外 CFU-F 形成能力显著低于 对照组。研究者利用 Annexin V 凋亡检测试剂盒 对两组细胞的凋亡率进行检测后发现，AA 组 BMMSCs 凋亡细胞率（8.09%±3.32%）明显高于健康 对照组（5.00%±2.59%）。也有实验将 AA 患者 和正常对照组 BM-MSCs 进行体外培养，均发现不 同程度的 BM-MSCs 总量减少、增殖能力、自我更 新能力等的异常^[28]。

因而不难推论，AA 患者的 BM-MSCs 自我更 新及增殖能力低于正常人，更严重的是伴随着凋 亡率的增加，BM-MSCs 这类骨髓基质细胞数目锐 减，必然造成造血干细胞损伤易感性增加，因此 BM-MSCs 的这些变化极有可能加重 AA 的疾病进 展。 3.2　AA 患者 BM-MSCs 分化潜能异常

BM-MSCs 在骨髓微环境中可以分化为成骨细 胞和脂肪细胞，这是可以互相转化的两个可逆的 调节，而骨髓逐步脂肪化则是 AA 最主要的一个病 理特征。

岳寒等^[29] 以脂蛋白脂酶（LPL）作为标志性 基因，应用 PCR 技术检测其作为晚期脂肪形成标 志在 AA 患者和正常人 BM-MSCs 中的表达差异， 发现 AA 患者的 BM-MSCs 在诱导脂肪形成的过程 中，早、中期（7 d、14 d）LPL 基因的表达较正常 人明显增高，晚期（21 d）表达亦增加。提示 AA 患者 BM-MSCs 有更强的易成脂性，影响造血干细 胞的增殖和分化，从而参与 AA 的发病。

程梅等^[27] 分别用成骨诱导液及成脂肪诱导 液对 AA 患者和对照组的 BM-MSCs 进行培养，经 油红 O 及茜红素染色鉴定，发现 AA 患者的 BMMSCs 成脂肪细胞分化诱导率高于对照组（85% vs 60%，P<0.05），而成骨细胞分化诱导率低于对 照组（45% vs 65%，P<0.05）；收集诱导后细胞 在转录水平分别检测相关基因表达情况后发现， AA 患者 BM-MSCs 成脂肪细胞相关基因 PPARγ mRNA、FABP4 mRNA 表达水平上调而成骨细胞相 关基因 ALP mRNA 和 BGLAP mRNA 的表达水平下 调；Tripathy 等^[30] 通 过 RT-PCR 和 Western blot 分 析发现 AA 患者 BM-MSCs 脂联素和 FABP4 mRNA 及蛋白表达水平较正常对照高，而与成骨分化相 关的骨桥蛋白基因表达水平较对照组则无明显差 异；Li 等^[12] 在筛查验证基因表达谱时亦发现 AA 患者 BM-MSCs 与成脂肪信号通路相关的细胞因 子表达水平较正常人上调；Xu 等^[31] 研究发现 AA 患者的 BM-MSCs 较正常对照相比，对成脂分化 具有抑制作用的转录因子 GATA-2 表达降低，而 PPARγ 的表达则是明显上调的；El-Mahgoub 等 ^[26] 在儿童 AA 患者中亦发现类似的结果。以上这些研 究结果表明：AA 的 BM-MSCs 存在成脂肪细胞和 成骨细胞分化失衡。因为成骨细胞是造血干细胞 壁龛的重要组成细胞^[32]，造血干细胞伴随成骨细 胞同时增加或减少，成骨细胞的相对损失会导致 造血受损^[33] ，因此推测 BM-MSCs 的分化潜能异常 有可能会促使 AA 患者成骨细胞相对减少，骨髓脂 肪化，进而引起造血干细胞壁龛减少，并最终导 致 AA 患者造血功能衰竭。 4　AA 患者 BM-MSCs 免疫调节功能紊乱 4.1　AA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞增殖活化 的影响

近年来有大量实验证明 AA 患者 BM-MSCs 对 淋巴细胞的增殖和活化的抑制作用减弱，使其成 为AA 发病的重要机制之一^{[11, 34]}。Liu 等^[23] 通过 PHA 刺激的 T 淋巴细胞增殖实验、混合淋巴细胞 培养（MLR）反应和 T 淋巴细胞周期检测比较正 常志愿者和 AA 患者两组 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞 的抑制作用发现，正常的 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞 增殖的抑制作用明显（均抑制至 1% 以下），而 AA 患者的 BM-MSCs 抑制增殖的能力存在明显缺 陷（抑制率仅仅为 61% 和 43%），且经免疫抑制 剂治疗后，抑制率仍无明显改变。PHA 刺激后的 T 淋巴细胞在加入正常志愿者 BM-MSCs 后，活化 的 T 淋巴细胞被阻滞在 G0/G1 期，更少进入 S 期， 而加入患者 BM-MSCs 后虽也能将 T 淋巴细胞阻滞 在 G0/G1 期，但这种能力相对较弱。Bacigalupo 等^[35] 对重型再生障碍性贫血（SAA）患者与健康对照者 的 BM-MSCs 在混合淋巴细胞培养反应（MLR）、 PHA 刺激的 T 淋巴细胞增殖实验对比发现相似的 结果，并且这种缺陷在免疫抑制治疗后依然存在， 只有在骨髓移植后才可能恢复。来自于 SAA 和 NSAA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞的抑制作用存 在差异，后者的 BM-MSCs 对活化 T 淋巴细胞的抑 制作用的减弱不如前者显著，也许这能够用来说 明为什么 SAA 患者的造血功能更难以恢复。值得 注意的是，Xu 等^[36] 在对比 34 个儿童 AA 患者与 正常对照来源的 BM-MSCs 在 PHA 刺激的 T 淋巴 细胞增殖实验中的反应后，并没有发现 Bacigalupo 所发现的差异，二者对剂量依赖性的 T 细胞增殖 抑制作用均存在且并没有明显的差异，两种不同 的观察结果除了可能由于样本量的差异外，亦不 排除儿童 AA 与成人 AA 发病机制可能存在差异性。 4.2　AA 患者 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞各亚群比 例及功能的作用

目前认为 AA 的重要发病机制是免疫异常， 即 CD8⁺ CTL 功能亢进，CD4 ⁺ Th1/Th2 失衡及 Treg 细胞数目减少及功能缺陷^[37]，多年的实验室研 究证据表明，正常的脐带来源的间充质干细胞 （hUC-MSCs）及 BM-MSCs 均具备对不同T 细胞 亚群的免疫调节功能，而与正常人相比，AA 患者 的 BM-MSCs 无论从质量还是数量都存在异常 ^{[38, 39, 40, 41, 42]}， 因此有学者推测这样的异常极有可能会加重 AA 本 就失衡的免疫调节系统^[11] ，BM-MSCs 固有的免疫 抑制作用的减低，必然会造成 CD8⁺CTL 功能亢进 及 Treg 细胞功能减低，T 淋巴细胞亚群的失衡而 致机体免疫紊乱，其中功能亢进的 CD8⁺CTL 可以 激活 Fas 凋亡途径，使得造血干 / 祖细胞大量凋亡。 虽然在临床上已经有通过输注第三方供者来源的 BM-MSCs 使部分 AA 患者获得缓解并脱离血制品 输注的病例报道^{[43, 44, 45, 46]}，然而这种治疗的作用机制 并不明确，不过可以肯定的是，AA 患者 BM-MSCs 数量减少及功能缺陷不仅可使其支持造血功能缺 陷，还会影响其对免疫细胞的抑制能力，致使体 内 T 淋巴细胞和 NK 细胞异常活化损伤造血细胞， 最终导致造血功能衰竭。

陈新等^[10] 提取 hUC-MSCs 并在体外检测不同 浓度 hUC-MSCs 对 AA 患者 T 淋巴细胞的抑制率发 现，hUC-MSCs 能调整 AA 患者倒置的 CD4⁺ /CD8⁺ 比例，抑制 AA 患者造血负调控因子 IL-2、IFN-γ 分泌水平，且这种免疫调节作用依赖于 hUC-MSCs 的数量，这也在一定程度上从侧面反映了 AA 缺陷 的 BM-MSCs 对 T 淋巴细胞的比例及功能的影响。 4.3　AA 患者 BM-MSCs 与 Treg 细胞

研究证实 AA 患者体内的 Treg 细胞水平较正 常人下降，而 Th17 细胞水平较正常人则是上升的， 这种比例在免疫抑制治疗成功后可以逐渐恢复正 常^{[47, 48, 49]}，而正常 MSCs 也能通过其免疫调节作用使 得 Treg 细胞数目扩增，其机制并非仅仅同传统的 免疫抑制治疗一样针对自身反应性 T 细胞群，Yan 等^[50] 研究发现，MSC 不仅增加 Treg 细胞 IL-10、 TGF-β 的分泌，还可以上调 Treg 细胞 PD-1 的表 达，通过增强 PD-1/B7-H1 相互作用而放大 Treg 细 胞的免疫调节功能，也有研究者构建了人类胚胎 干细胞来源的 MSCs 诱导 Treg 细胞扩增的模型， 即 MSCs 分泌外泌体囊泡（exosomes），并通过 单核细胞表面 TLR 受体信号通路分泌细胞因子 IL-10 等，从而诱导 CD4⁺ T 淋巴细胞分化成为 Treg 细胞^[51] 。但AA 患者缺陷的BM-MSCs 是否影响 Treg 细胞发挥免疫调节作用，以及 BM-MSCs 是否 能在治疗中与免疫抑制剂、骨髓生长因子等联合 使用治疗 AA，尚待进一步证实。

柴晔等^[52] 将 hUC-MSCs 与 AA 患者外周血单 个核细胞以不同比例共培养，发现能增加 Foxp3 mRNA 相对表达量及 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺Treg 细胞占 外周血 CD4⁺ T 细胞比例，且 hUC-MSCs 能增加 AA 患者 Treg 细胞数量，其可能的机制是通过细胞间 接触分泌可溶性细胞因子（TGF-β、HGF 等）诱 导 Treg 细胞产生。刘增慧等^[53] 利用流式细胞仪检 测了 13 例 SAA、17 例慢性再生障碍性贫血（CAA） 及 10 例健康对照者外周血 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg 表达发现 AA 患者表达明显低于健康对照者；且 SAA 表达较 CAA 低；进一步对其中 7 例应用免 疫抑制治疗 1 年以上无效的 AA 患者进行亲缘供 者 BM-MSCs 静脉回输（剂量（1~10）×10 ⁶ /kg， 1 次 / 周，4 周为 1 疗程），检测对比回输治疗前 后外周血 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺Treg 表达发现，异体 BM-MSCs 治疗后 AA 患者外周血 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg 表达上调，这种上调作用在应用BM-MSCs 回输治疗第1 个疗程后即可出现，第2 个疗程 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺Treg 细胞表达依然上升，最高时 可接近正常水平，总体上逐步趋于稳定，但维持 时间尚不确定。因此推测，MSCs 治疗有可能上调 AA 患者 CD4⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺Treg 细胞的表达，而更 确切的临床结论则需要进一步更多临床病例的对 比研究以及更长的临床进程研究。MSCs 作为一种 强大的免疫调节细胞，可能有诱导机体产生 Treg 细胞以维持免疫耐受，发挥免疫抑制作用，这一 推测也为 AA 细胞治疗的进一步研究提供了理论依 据。

综上所述，尽管目前也有学者认为 AA 患者 的 BM-MSCs 与正常人相比，在表型、造血支持作 用乃至免疫应答及抗炎作用方面均没有明显的差 别^[54] ，但越来越多的实验室证据证明了 BM-MSCs 缺陷在 AA 的发病中极有可能起着重要的作用，无 论是其生物学特点、基因表达谱的缺陷，抑或是 增殖分化能力、造血支持作用乃至免疫调节功能 的耗竭，都成为在免疫失衡基础上促使 AA 不断进 展至难以恢复的重要节点，随着 MSCs 研究的不断 深化，将恢复骨髓造血微环境为主要目的的 MSCs 输注可能成为 AA 治疗的新模式^{[55, 56, 57, 58]}。