急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）在儿童恶性肿瘤中最常见，约占淋 巴细胞白血病的70%~80%。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）用于肿瘤治疗已逾50 年，目前仍是治疗 ALL 最重要的药物之一，MTX 为叶酸类似物，主 要借助于还原叶酸载体的转运进入细胞，大剂量MTX（HD-MTX）是ALL 髓外白血病防治的重要 措施，胸苷酸合成酶（TS）是叶酸代谢的重要相 关酶，TS 的多态性可导致叶酸代谢相关酶活性的 下降，影响叶酸的正常代谢，TS 常见的3 种基因 型为2R/2R、2R/3R、3R/3R。在临床应用时，HDMTX 可导致严重的骨髓抑制、肝脏毒性、肾脏毒 性、胃肠道反应、黏膜损害（口腔炎）等不良反 应，MTX 因严重的不良反应被迫中断，常常是导 致ALL 复发和患者治疗相关死亡的原因之一。临 床实践中不难发现：不同患者经HD-MTX 治疗后 疗效及相关不良反应亦不同，尤其是不良反应存 在明显的个体差异。因此，研究一个对HD-MTX 化疗相关毒副反应的预测指标对ALL 患儿MTX 的 合理用药是非常有益的，以期为实现个体化治疗 指明方向。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2011 年3 月至2013 年3 月在湖南省人 民医院儿科和湖南省儿童医院住院的ALL 患儿 73 例为研究对象，所有患儿确诊均参照儿童ALL 诊疗建议^[1]，且目前均处于缓解期。其中男34 例， 女39 例，年龄范围1 岁8 个月至11 岁11 个月； 标危37 例，中危及高危共36 例。分别记录患儿 化疗前后的血常规（中性粒细胞计数、血红蛋白、 血小板）、肝功能、肾功能，以及临床症状，包 括有无胃肠道反应、口腔炎等。该研究获得患儿 监护人同意并签署知情同意书。 1.2 化疗方案

参照CCLG-ALL 2008 方案，所有ALL 患儿均 行HD-MTX+ 亚叶酸钙（CF）+6- 巯基嘌呤（6-MP） 方案化疗，MTX 使用剂量：标危3 g/m²，中危及 高危5 g/m²。MTX 采用24 h 静脉滴注，10% 剂量 作为突击量在0.5 h 内快速静脉均匀滴入，余量于 23.5 h 内均匀滴入，在行突击量MTX 静脉滴注后 2 h 内，行三联（MTX+ 阿糖胞苷+ 地塞米松）鞘 注1 次。静脉滴注MTX 后36~42 h 用CF 解救， 剂量为15 mg/m²，每6 h 给药1 次，共6~8 次。 行化疗方案当天及后2 d 需大剂量水化碱化（每 日液体总量：3 000 mL/m²，每日总碱量：5% 碳酸 氢钠130 mL/m²）。给药期间，监测24 h 出入水 量，保持尿pH ≥ 7.0；同时，每晚睡前顿服6-MP （25 mg/m²）；化疗过程中常规对口腔黏膜、胃肠 道及重要脏器进行保护。 1.3 Real-Time PCR 检测TS 基因多态性

清晨空腹采集ALL 患儿外周静脉血2 mL，置 于EDTA 抗凝试管中4℃保存，48~72 h 内，使用 天根试剂公司的血药基因组DNA 试剂盒（离心柱 型DP318），按照试剂盒说明书提取DNA。将提 取的DNA 进行Real-Time PCR 扩增。根据Genbank 检索到的TS 核苷酸序列，并参考文献^[2] 设计TS 基因引物，由华大基因科技股份有限公司合成。 TS 上游引物：5'-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3'， 下游引物：5'-CCAAGCTTGGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG- 3'，片段长度：251 bp。PCR 反应体系（30 μL），包括Mix 15 μL，上下游引物 各1.5 μL，DNA 模板10 μL，去离子水2 μL。反应 条件为：95℃预变性2 min；94℃变性30 s，62℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，共36 个循环；72℃再 延伸7 min。取扩增产物5 μL 与Marker 7.5 μL 混 合，于3% 琼脂糖凝胶中，以100 mV 电压电泳 45 min，并在凝胶成像系统中拍照分析。将剩余的 PCR 产物原液送华大基因，纯化后进行直接测序。 1.4 化疗后不良反应指标检测

HD-MTX 化疗前后及化疗过程中监测患儿生 命体征及实验室检查结果（每2~3 d 测一次血常规、 肝功能、电解质和肾功能），观察记录临床症状。 HD-MTX 化疗开始后42~48 h 采集患儿外周静脉血 2 mL，立即送本院临床药学研究所，行MTX 血药 浓度监测。

记录患儿行HD-MTX 化疗过程中出现的不良 反应，根据美国国立癌症研究所常规毒性判定标 准（NCI-CTC）评价不良反应^[3]。评价观察的指标 有：骨髓抑制（表现为外周血中性粒细胞减少、 血红蛋白和血小板降低）；肝脏毒性（表现为谷 丙转氨酶升高）；肾脏毒性（表现为尿素氮升高）； 胃肠道反应（表现为呕吐、腹泻）；黏膜损害（表 现为口腔炎）。分级≥Ⅱ级被认为是临床相关的 化疗毒副反应。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 美国国立癌症研究所常规毒性判定标准

表 1 美国国立癌症研究所常规毒性判定标准

应用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行统计学 分析。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采 用校正χ² 检验或Fisher 确切概率法，p<0.05 为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 不同危险度分型患儿TS 基因型分布

TS 基因检测结果显示，73 例患儿中，2R/2R 型3 例（4%），2R/3R 型 12 例（16%），3R/3R 型 58 例（79%）。不同危险度分型ALL 患儿基因型分 布频率比较差异无统计学意义（p>0.05），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同危险度分型ALL 患儿TS 基因型分布比较 [例（%）]

表 2 不同危险度分型ALL 患儿TS 基因型分布比较 [例（%）]

73 例ALL 患儿接受HD-MTX 化疗后，发生中 性粒细胞减少、血红蛋白降低和血小板减少分别 为51 例（70%）、40 例（55%）和6 例（8%）； 发生肝脏毒性、黏膜损害和胃肠道反应者分别为 8 例（11%）、9 例（12%） 和9 例（12%）； 无 1 例发生肾脏毒性。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 73 例ALL 患儿化疗后不良反应发生情况 [例（%）]

表 3 73 例ALL 患儿化疗后不良反应发生情况 [例（%）]

结果显示，不同TS 基因型ALL 患儿化疗后 不良反应发生率比较差异均无统计学意义（均 p>0.05），见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 不同TS 基因型ALL 患儿化疗后不良反应发生率比较 [例（%）]

表 4 不同TS 基因型ALL 患儿化疗后不良反应发生率比较 [例（%）]

ALL 患儿化疗后42~48 h MTX 血药浓度监测 结果提示：2R/2R 型、2R/3R 和3R/3R 型ALL 患 儿化疗后42~48 h MTX>0.5 μmol/L 分别有0 例、 3 例和3 例，说明TS 基因多态性与MTX 化疗后血 药浓度的变化无关联（p>0.05），见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 TS 基因型与MTX 血药浓度之间的关系 [例（%）]

表 5 TS 基因型与MTX 血药浓度之间的关系 [例（%）]

尽管目前对ALL 的治疗已取得了很大进展， 但MTX 目前仍是治疗ALL 最重要的药物之一。 MTX 为叶酸类似物，主要借助于还原叶酸载体的 转运进入细胞，MTX 和二氢叶酸竞争，与二氢叶 酸还原酶（DHFR）结合，从而使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸，同时进入细胞的MTX 在甲氨 蝶呤聚谷氨酸合成酶（FPGS）的催化作用下，在 MTX 的γ- 羧基位上加上约7~10 个谷氨酸残基， 形成MTX 多聚谷氨酸（MTXPG），多聚谷氨酸 化可增强MTX 的作用，抑制TS 和甲酰基转移酶 （GARTFase），并由于快速出胞被阻断使MTX 胞 内滞留时间延长。因缺乏四氢叶酸，一碳单位形 成减少，DNA、RNA 合成受限，快速增生的肿瘤 细胞如淋巴母细胞因缺乏复制所需的原料而逐渐 死亡。HD-MTX 是ALL 髓外白血病防治的重要措施， 其机制是在HD-MTX 治疗时，MTX 血药浓度很高， 可顺利通过血脑屏障进入中枢神经系统（CNS）， 同时三联鞘注，从而有效地杀灭隐蔽在CNS 的白 血病细胞，减少复发^[4]。

TS 是胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP）合成过程中 的限速酶，其功能是以5,10- 亚甲基四氢叶酸为原 料，催化尿嘧啶脱氧核苷（dUMP）甲基化为胸腺 嘧啶脱氧核苷（dTMP），而 dTMP 又是DNA 生物 合成所必需的。因此，通过对 TS 进行抑制就能达 到抑制DNA 的生物合成进而抑制细胞生长或增殖 的作用。TS 在 DNA 合成与修复、细胞增殖与分化 中有十分重要的作用，是肿瘤化疗药 5- 氟尿嘧啶 （5-Fu）和MTX 等的重要靶酶。

本研究发现TS 各基因型与HD-MTX 化疗后不 良反应的发生无明显相关，与Kishi 等^[5] 的研究结 果一致。然而，Faganel 等^[6] 研究显示，ALL 患儿 进行HD-MTX 化疗后，TS 2R/3R 基因型携带者的 血小板减少和黏膜炎发生风险明显下降。同时一 项成人研究表明，TS 3R/3R 基因型可增加ALL 化 疗后贫血的危险性^[7]。

本研究未发现TS 基因多态性与MTX 血药浓 度之间存在关联。此外，HD-MTX 化疗相关不良 反应还可能与其他叶酸代谢途径相关基因多态性 存在相关性^{[6, 8]}。

综上所述，TS 基因多态性与ALL 患儿HDMTX 化疗后不良反应的发生风险无关，并未达到 预期研究目的，需要综合其他叶酸代谢相关酶的 基因多态性以及协同作用、体内叶酸水平、同时 服用的化疗药物及扩大样本量来进一步求证。