2. 湖南省儿童医院血液内科, 湖南 长沙 410005
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)在儿童恶性肿瘤中最常见,约占淋 巴细胞白血病的70%~80%。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)用于肿瘤治疗已逾50 年,目前仍是治疗 ALL 最重要的药物之一,MTX 为叶酸类似物,主 要借助于还原叶酸载体的转运进入细胞,大剂量MTX(HD-MTX)是ALL 髓外白血病防治的重要 措施,胸苷酸合成酶(TS)是叶酸代谢的重要相 关酶,TS 的多态性可导致叶酸代谢相关酶活性的 下降,影响叶酸的正常代谢,TS 常见的3 种基因 型为2R/2R、2R/3R、3R/3R。在临床应用时,HDMTX 可导致严重的骨髓抑制、肝脏毒性、肾脏毒 性、胃肠道反应、黏膜损害(口腔炎)等不良反 应,MTX 因严重的不良反应被迫中断,常常是导 致ALL 复发和患者治疗相关死亡的原因之一。临 床实践中不难发现:不同患者经HD-MTX 治疗后 疗效及相关不良反应亦不同,尤其是不良反应存 在明显的个体差异。因此,研究一个对HD-MTX 化疗相关毒副反应的预测指标对ALL 患儿MTX 的 合理用药是非常有益的,以期为实现个体化治疗 指明方向。 1 资料与方法 1.1 研究对象
选取2011 年3 月至2013 年3 月在湖南省人 民医院儿科和湖南省儿童医院住院的ALL 患儿 73 例为研究对象,所有患儿确诊均参照儿童ALL 诊疗建议[1],且目前均处于缓解期。其中男34 例, 女39 例,年龄范围1 岁8 个月至11 岁11 个月; 标危37 例,中危及高危共36 例。分别记录患儿 化疗前后的血常规(中性粒细胞计数、血红蛋白、 血小板)、肝功能、肾功能,以及临床症状,包 括有无胃肠道反应、口腔炎等。该研究获得患儿 监护人同意并签署知情同意书。 1.2 化疗方案
参照CCLG-ALL 2008 方案,所有ALL 患儿均 行HD-MTX+ 亚叶酸钙(CF)+6- 巯基嘌呤(6-MP) 方案化疗,MTX 使用剂量:标危3 g/m2,中危及 高危5 g/m2。MTX 采用24 h 静脉滴注,10% 剂量 作为突击量在0.5 h 内快速静脉均匀滴入,余量于 23.5 h 内均匀滴入,在行突击量MTX 静脉滴注后 2 h 内,行三联(MTX+ 阿糖胞苷+ 地塞米松)鞘 注1 次。静脉滴注MTX 后36~42 h 用CF 解救, 剂量为15 mg/m2,每6 h 给药1 次,共6~8 次。 行化疗方案当天及后2 d 需大剂量水化碱化(每 日液体总量:3 000 mL/m2,每日总碱量:5% 碳酸 氢钠130 mL/m2)。给药期间,监测24 h 出入水 量,保持尿pH ≥ 7.0;同时,每晚睡前顿服6-MP (25 mg/m2);化疗过程中常规对口腔黏膜、胃肠 道及重要脏器进行保护。 1.3 Real-Time PCR 检测TS 基因多态性
清晨空腹采集ALL 患儿外周静脉血2 mL,置 于EDTA 抗凝试管中4℃保存,48~72 h 内,使用 天根试剂公司的血药基因组DNA 试剂盒(离心柱 型DP318),按照试剂盒说明书提取DNA。将提 取的DNA 进行Real-Time PCR 扩增。根据Genbank 检索到的TS 核苷酸序列,并参考文献[2] 设计TS 基因引物,由华大基因科技股份有限公司合成。 TS 上游引物:5'-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3', 下游引物:5'-CCAAGCTTGGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG- 3',片段长度:251 bp。PCR 反应体系(30 μL),包括Mix 15 μL,上下游引物 各1.5 μL,DNA 模板10 μL,去离子水2 μL。反应 条件为:95℃预变性2 min;94℃变性30 s,62℃ 退火30 s,72℃延伸30 s,共36 个循环;72℃再 延伸7 min。取扩增产物5 μL 与Marker 7.5 μL 混 合,于3% 琼脂糖凝胶中,以100 mV 电压电泳 45 min,并在凝胶成像系统中拍照分析。将剩余的 PCR 产物原液送华大基因,纯化后进行直接测序。 1.4 化疗后不良反应指标检测
HD-MTX 化疗前后及化疗过程中监测患儿生 命体征及实验室检查结果(每2~3 d 测一次血常规、 肝功能、电解质和肾功能),观察记录临床症状。 HD-MTX 化疗开始后42~48 h 采集患儿外周静脉血 2 mL,立即送本院临床药学研究所,行MTX 血药 浓度监测。
记录患儿行HD-MTX 化疗过程中出现的不良 反应,根据美国国立癌症研究所常规毒性判定标 准(NCI-CTC)评价不良反应[3]。评价观察的指标 有:骨髓抑制(表现为外周血中性粒细胞减少、 血红蛋白和血小板降低);肝脏毒性(表现为谷 丙转氨酶升高);肾脏毒性(表现为尿素氮升高); 胃肠道反应(表现为呕吐、腹泻);黏膜损害(表 现为口腔炎)。分级≥Ⅱ级被认为是临床相关的 化疗毒副反应。见表 1。
应用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行统计学 分析。计数资料以百分率(%)表示,组间比较采 用校正χ2 检验或Fisher 确切概率法,p<0.05 为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 不同危险度分型患儿TS 基因型分布
TS 基因检测结果显示,73 例患儿中,2R/2R 型3 例(4%),2R/3R 型 12 例(16%),3R/3R 型 58 例(79%)。不同危险度分型ALL 患儿基因型分 布频率比较差异无统计学意义(p>0.05),见表 2。
73 例ALL 患儿接受HD-MTX 化疗后,发生中 性粒细胞减少、血红蛋白降低和血小板减少分别 为51 例(70%)、40 例(55%)和6 例(8%); 发生肝脏毒性、黏膜损害和胃肠道反应者分别为 8 例(11%)、9 例(12%) 和9 例(12%); 无 1 例发生肾脏毒性。见表 3。
结果显示,不同TS 基因型ALL 患儿化疗后 不良反应发生率比较差异均无统计学意义(均 p>0.05),见表 4。
ALL 患儿化疗后42~48 h MTX 血药浓度监测 结果提示:2R/2R 型、2R/3R 和3R/3R 型ALL 患 儿化疗后42~48 h MTX>0.5 μmol/L 分别有0 例、 3 例和3 例,说明TS 基因多态性与MTX 化疗后血 药浓度的变化无关联(p>0.05),见表 5。
尽管目前对ALL 的治疗已取得了很大进展, 但MTX 目前仍是治疗ALL 最重要的药物之一。 MTX 为叶酸类似物,主要借助于还原叶酸载体的 转运进入细胞,MTX 和二氢叶酸竞争,与二氢叶 酸还原酶(DHFR)结合,从而使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸,同时进入细胞的MTX 在甲氨 蝶呤聚谷氨酸合成酶(FPGS)的催化作用下,在 MTX 的γ- 羧基位上加上约7~10 个谷氨酸残基, 形成MTX 多聚谷氨酸(MTXPG),多聚谷氨酸 化可增强MTX 的作用,抑制TS 和甲酰基转移酶 (GARTFase),并由于快速出胞被阻断使MTX 胞 内滞留时间延长。因缺乏四氢叶酸,一碳单位形 成减少,DNA、RNA 合成受限,快速增生的肿瘤 细胞如淋巴母细胞因缺乏复制所需的原料而逐渐 死亡。HD-MTX 是ALL 髓外白血病防治的重要措施, 其机制是在HD-MTX 治疗时,MTX 血药浓度很高, 可顺利通过血脑屏障进入中枢神经系统(CNS), 同时三联鞘注,从而有效地杀灭隐蔽在CNS 的白 血病细胞,减少复发[4]。
TS 是胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)合成过程中 的限速酶,其功能是以5,10- 亚甲基四氢叶酸为原 料,催化尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)甲基化为胸腺 嘧啶脱氧核苷(dTMP),而 dTMP 又是DNA 生物 合成所必需的。因此,通过对 TS 进行抑制就能达 到抑制DNA 的生物合成进而抑制细胞生长或增殖 的作用。TS 在 DNA 合成与修复、细胞增殖与分化 中有十分重要的作用,是肿瘤化疗药 5- 氟尿嘧啶 (5-Fu)和MTX 等的重要靶酶。
本研究发现TS 各基因型与HD-MTX 化疗后不 良反应的发生无明显相关,与Kishi 等[5] 的研究结 果一致。然而,Faganel 等[6] 研究显示,ALL 患儿 进行HD-MTX 化疗后,TS 2R/3R 基因型携带者的 血小板减少和黏膜炎发生风险明显下降。同时一 项成人研究表明,TS 3R/3R 基因型可增加ALL 化 疗后贫血的危险性[7]。
本研究未发现TS 基因多态性与MTX 血药浓 度之间存在关联。此外,HD-MTX 化疗相关不良 反应还可能与其他叶酸代谢途径相关基因多态性 存在相关性[6, 8]。
综上所述,TS 基因多态性与ALL 患儿HDMTX 化疗后不良反应的发生风险无关,并未达到 预期研究目的,需要综合其他叶酸代谢相关酶的 基因多态性以及协同作用、体内叶酸水平、同时 服用的化疗药物及扩大样本量来进一步求证。
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