2. 中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所 血液病理诊断中心, 天津 300020
2008 年WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类标 准[1]将儿童骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)分为难治性血细胞减少(refractory cytopenia of childhood,RCC)、难治性贫血伴原 始细胞增高(refractory anemia with excess blasts, RAEB)、难治性血细胞减少伴原始细胞增高-转化型(refractory anemia with excess blasts in transformation,RAEB-t)。
RCC 是一个新提出的暂定分类,其诊断标准 为:持续的血细胞减少伴外周血原始细胞 <2%, 骨髓原始细胞 <5%,且一系病态造血比例大于 10% 或两系病态造血,并除外其他骨髓衰竭性疾 病及继发性 MDS [1]。这一亚型的提出是基于原始 细胞不高的儿童 MDS 具有一些与成人 MDS 不同的 临床特征,包括:成人 MDS 分类中的难治性贫血 伴环状铁粒幼细胞贫血,MDS 伴单纯 5q-在儿童 罕见[2];以单纯贫血(即成人的难治性贫血)起病 在儿童少见,多伴有中性粒细胞和(或)血小板 减少[3, 4];骨髓增生减低更常见。因此,成人“低危” MDS 的分类不适用于儿童 MDS 患者。
RCC 包含了骨髓增生重度减低伴轻度病态造 血的患儿和骨髓增生程度正常伴明显病态造血的 符合成人难治性血细胞减少伴多系病态造血的患 儿。骨髓增生减低的 RCC 与另一大类骨髓衰竭 性疾病—获得性再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA),特别是与非重型 AA 的鉴别诊断存在困难: 两者均表现为骨髓增生减低,病态造血不易识别, 无特定的免疫学和细胞遗传学标志。RCC 与非重 型 AA 均为慢性病程,需要长期随访才能判断两者 临床转归。从发病机制上讲,RCC 是一种恶性克 隆性疾病,有着潜在的向白血病转化的风险,而 非重型 AA 是一种主要由免疫介导的良性疾病,分 析两者的临床特征及转归,对临床治疗选择具有 重要的意义。本研究回顾性分析儿童 RCC 的临床 特征、疗效及临床转归,现报告如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象
研究对象为1990年1月至2013年6月我院 门诊及住院符合以下标准的患者:(1)年龄 0~14 岁之间;(2)初始诊断为非重型 AA;(3)初诊 时的骨髓细胞形态学及骨髓病理学资料均完整; (4)至我院前未进行治疗。
排除标准:(1)初始诊断为重型 AA/ 超重型 AA 的患者;(2)具有可疑的先天性骨髓衰竭的 体征或实验室检查结果,如肢体畸形和(或)丝 裂霉素断裂实验阳性和(或)单个细胞凝胶电泳 实验阳性;(3)有可疑的血液系统疾病和(或) 肿瘤家族史;(4)既往有化疗药物治疗史和(或) 放射线接触史;(5)怀疑继发于感染、维生素缺 乏或自身免疫病的血细胞减少。
非重型 AA 诊断标准参照文献[5, 6];重型及超 重型 AA 诊断标准参照文献[6]。
该研究经中国医学科学院北京协和医学院血 液病医院血液学研究所伦理委员会批准。 1.2 骨髓形态学回顾性分析
患儿骨髓细胞形态学和骨髓组织病理学由 3 名专家重新评估。诊断流程及标准参考既往研 究[7, 8, 9, 10]。骨髓细胞形态学、骨髓病理学样本根据 FAB(French-American-British Cooperative Leukemia Working Group)和 EWOG-MDS(the morphology group of the European Working Group MDS in children)标准 评估[11, 12]。RCC 的诊断根据 WHO 2008 标准[1]。骨 髓纤维化分级根据既往报道[13]。 1.3 染色体核型分析
骨髓细胞染色体核型分析采用R显带技 术。异常染色体核型描述根据2009年ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) 标准[14] 和 IWGMC(International Working Group on MDS Cytogenetics)共识指南 [15]。 因骨髓增生减低本身会造成染色体核型分析成功 率低,本研究用至少 10 个中期分裂相替代原标准 中至少 20 个中期分裂相作为可分析的样本。≥ 2 个分裂相的相同的结构异常或染色体增加认为是 存在异常克隆。≥ 3 个分裂相相同的染色体缺失 认为是存在异常克隆。 1.4 诊断标准
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)为至少 3 次 Ham 实验阳性或两系糖基磷脂酰肌醇锚蛋白 (GPI-AP)克隆缺失 >20% ,伴溶血的临床症状和 实验室检查证据(如血红蛋白尿、结合珠蛋白降 低、乳酸脱氢酶增高及尿胆红素增高)。PNH 克 隆采用流式细胞技术检测(抗-CD55 和抗-CD59)。 MDS 及 AML 的诊断及分型根据 WHO 2008 标准 [1]。 1.5 随访
随访方式为每 3~6 月一次门诊或住院复诊时 评估。所有患儿均在2013年6~7月电话随访一 次最新情况。随访终点为患儿死亡或2013年7月 30日。最终有130例RCC患儿可随访到临床转 归。失访率14%,中位随访时间为36个月(范围 1~283个月)。随访评估内容包括全血细胞计数、 骨髓细胞形态学、骨髓组织病理学、染色体核型 分析及血细胞 CD55/CD59 表达水平等。 1.6 疗效评价标准
参考文献标准判定疗效等级(表 1)[16, 17]。必 须以至少连续两次、间隔至少 4 周全血细胞计数 结果来评估疗效。
所有统计学处理均应用 SPSS 17.0 统计软件完 成。非正态分布资料用中位数(范围)表示,组 间比较采用 Mann-Whitney U检验。总体生存采用 Kaplan-Meier 法估算,组间比较采用非参数检验。 多因素分析均采用 Cox 回归模型。P<0.05为差异 有统计学意义。 2 结果 2.1 RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征的比较
本研究共纳入 1 420 例既往诊断为非重型 AA 的患儿,最终经过骨髓细胞形态学和骨髓病理学 回顾性分析,152 例(10.70%)重新诊断为 RCC, 其余仍诊断为非重型 AA。RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征见表 2。与非重型 AA 相比,RCC 患 儿发病时 Hb 较低(P=00.001),胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)较高(P=00.037)。
骨髓细胞形态学和组织病理学分析显示 RCC 患儿红系、粒系和巨核细胞病态造血的比例分别 为 75.0%、53.9% 和 40.1%(巨核细胞系病态造血 通过 CD41 免疫组化染色确定)。RCC 患儿 1 系、 2 系、3 系血细胞病态造血的比例分别为 44.7%、 36.2%、19.1%,而非重型 AA 患儿仅有 12.1% 表 现为单纯红系的轻度病态造血。RCC 造血细胞面 积高于非重型AA(P<0.001)。22.4% 和 31.0% 的 RCC 患儿可见淋巴样小巨核细胞和异常红细 胞造血岛。轻度的纤维化(3.5%)和不成熟前体 细 胞 异 常 定 位(abnormal localization of immature precursors,ALIP)(1.1%)在 RCC 患儿中罕见, 在非重型 AA 患儿未见。 2.2 细胞遗传学分析
79 例 RCC 和 302 例非重型 AA 有可供分析的 染色体核型结果。RCC 患儿发病时染色体核型异 常的比例高于非重型 AA[21.5%(17/79)vs 8.3% (25/302),P=00.001]。RCC 异常染色体核型包括: 7 号染色体单体 23.5%(4/17)、8 号染色体三体 17.6%(3/17)、复杂核型 17.6%(3/17)和其他异 常 41.2%(7/17)。有 4 例(4/62,6.5%)发病时 染色体核型正常的 RCC 患儿病程中出现异常染色 体核型,分别为 1 例 46,XY,i(7q),1 例两个克 隆 47,XY,+8,t(8;21)(q22;q22),-12, del(20)(q11),+21 和 46,XY,del(20)(q12) 和 2 例单纯 8 号染色体三体(表 3)。
RCC患儿接受下列4种治疗方案之一: (1)仅观察及支持治疗(15.2%);(2)仅雄激 素(包括安雄、达那唑及司坦唑醇)(16.0%)治疗; (3)仅环孢素(CSA)治疗(15.2%); (4)CSA和雄激素联合用药(53.6%)。接受药 物治疗的RCC患儿总体CR、PR、NR率分别为 19.0%(20/105)、26.7%(28/105)、54.3%(57/105)。 3个不同药物治疗组间疗效比较差异无统计学意 义(P=00.849)。未经药物治疗的观察组和药物治 疗组间疗效比较差异无统计学意义(P=00.498)。 RCC 患儿 6 个月、12 个月、24 个月有效率(CR+PR) 分 别 为 16.7%(21/126)、26.0%(32/123)、 45.4%(44/97)。
6 例RCC 患儿在全血细胞计数进展至重型 AA/超重型AA水平时,接受了抗人T淋巴细胞免 疫球蛋白(ATG)联合CSA的强烈免疫抑制治疗 (IST),其中1例达CR,5例NR。3例患儿在 全血细胞计数进展至重型AA/超重型AA水平时 接受了造血干细胞移植。上述9例患儿未计入最 终的生存及白血病转化分析。 2.4 疗效预测因素
单因素分析表明患儿性别、年龄、诊断到开 始药物治疗的时间、治疗前 Hb、ANC、PLT 水平、 异常染色体核型、病态造血系别、骨髓造血细胞 面积与总 CR 率、总有效率均无相关性。多因素分 析未发现与总 CR 率、总有效率相关的独立因素。 2.5 复发
至随访终点,36.1%(44/122)RCC 患儿停药。 其中 25%(11/44)RCC 患儿停药后复发。除 1 例 患儿复发前有上呼吸道感染外,其余均无诱因。 停药后复发的中位时间为停药后 6.5 个月(范围 1~87 个月)。停药后复发的 11 例 RCC 患儿中, 3 例用原方案治疗仍有效。停药后复发与治疗方 案、CSA 疗程、雄激素疗程及 CSA 减量时间均无 关。Kaplan-Meier 法估计停药后 2 年累计复发率为 28.4%。11.5%(14/122)的患儿为治疗过程中复发 (即失去原来的 CR 或 PR),其中 3 例复发前有 上呼吸道感染,1 例伴 PNH,1 例伴染色体核型异 常,余均无诱因(表 3)。 2.6 总体生存及克隆演变分析
与非重型AA相比,RCC患儿总体生存较差 (P=00.032,图 1),5年和10年的预期生存率分 别为87.9%和72.4%,非重型AA分别为93.8%和 85.7%。本研究中克隆演变包括3种情况:急性白 血病、PNH和新出现的染色体异常,对非重型AA 患儿还包括MDS。至随访终点,RCC患儿克隆演 变率为10.0%(13/130)(表 3)。与非重型AA相比, RCC患儿克隆演变的风险较高(P<0.001,图 2), RCC患儿5年和10年的预期克隆演变率分别为 15.3%和20.0%,非重型AA患儿为0.8%和2.7%。 与非重型AA相比,RCC患儿病程中新出现染色 体核型异常的风险较高(P<0.001,图 3),RCC 患儿2年预期出现新的染色体异常率为3.6%,非 重型AA患儿为0.2%。RCC和非重型AA患儿10 年的预期PNH进展率分别为0.5%、0.3%,两者比 较差异无统计学意义(P=00.396)。RCC患儿5年 和10年预期白血病转化率为10.0%和20.0%,非 重型AA患儿为0.2%和1.2%,与非重型AA相比, RCC患儿白血病转化的风险较高(图 4)。
单因素分析表明发病时具有下列因素与 RCC 患儿总体生存率不良相关:Hb<90 g/L(P=00.022)、 ANC<1.2×109/L(P=00.006)、 发 病 时 染 色 体 核 型异常(P=00.011)、不良核型(涉及 7 号染色 体的异常核型或复杂核型)(P=00.011)、治疗 前 HbF ≤ 0.025(P=00.003)、骨髓 PAS 染色阳性 (P=00.049)。接受不同药物治疗方案的 RCC 患儿 总体生存率和白血病转化率差异无统计学意义; 接受支持治疗与药物治疗 RC 患儿总体生存率和白 血病转化率差异亦无统计学意义。 3 讨论
RCC 是2008 年WHO 造血与淋巴系统肿瘤 诊断分型标准对儿童 MDS 暂定的分类。RCC 是 儿童 MDS 最常见的类型,约占儿童 MDS 患者的 50% [1]。目前,对于这一以形态学为基础诊断的类 型尚有争议,原因在于:既往研究报道 RCC 具有 与 AA 相似的临床特征、对 IST 的疗效和临床转归 亦相似[18, 19];一部分先天性骨髓衰竭与 RCC 骨髓 形态相似[20, 21];全基因组测序发现 RCC 和儿童非 重型 AA 均表现为突变基因较少,两者在单个样本 平均突变数和具体突变基因上无显著性差异[19]。 因此,这种基于形态学的疾病分类的意义受到了 质疑。既往研究着重于 RCC 与重型 AA/ 超重型 AA 的比较,且随访时间较短。大多 RCC 患儿骨 髓增生程度较重型 AA/ 超重型 AA 轻,全血细胞 计数水平更接近于非重型 AA。非重型 AA 和 RCC 均表现为慢性病程,随访时间足够长才能获得准 确的临床转归。
本研究发现 RCC 患儿外周血 Hb 水平较低, 但骨髓增生程度正常甚至较活跃,特别是红系增 生较活跃,表现为红系比例增高、异常红系造血 岛及显著红系病态造血,因此 RCC 患儿具有无效 造血的特点。既往报道的较高的骨髓造血细胞面 积与非重型 AA 预后良好有关不同[22],本研究中 较高的骨髓造血细胞面积与 RCC 患儿的疗效及总 体生存无关,提示骨髓衰竭程度与 RCC 预后无关。
RCC 患儿具有克隆性造血的特点。与既往报 道非重型 AA 患儿相比[18, 19, 22],RCC 患儿起病时染 色体核型异常率较高,随着病程进展,克隆演变 率亦较高,尤其是向恶性克隆转化的风险较高。 分析表明非重型 AA 中向白血病转化的患儿可能与 治疗相关,如长期应用 G-CSF,多次强烈 IST 及相 继接受 ATG 及 CTX 治疗等。而 RCC 患儿中转化 为白血病者与具有 7 号染色体异常或复杂染色体 核型有关,与治疗无关。提示 RCC 本身具有较高 的向白血病转化的风险。另一方面,RCC 患儿向 PNH 转化率低。既往研究认为 AA 患者出现 PNH 克隆演变的发病机制主要是免疫异常导致的在骨 髓衰竭背景上的 PNH 克隆细胞免疫逃逸[23, 24, 25, 26]。与 既往研究一致[27] ,本研究中部分 RCC 患儿对 IST 亦有效,提示部分患儿发病与免疫异常有关。上 述结果提示,依据形态学诊断的 RCC 虽然具有可 操作性,但对探寻疾病的本质尚存局限性。
既往研究结果表明,输血依赖和(或)粒细 胞小于 1.0×109/L 的 RCC 对 IST 疗效与重型 AA 或超重型 AA 相似[28]。本研究结果与之有所不同, RCC 患儿对以 CSA 为主免疫抑制剂反应较非重型 AA 差,完全缓解率低。进展至重型 AA 或超重型 AA 时,行 IST 的有效率亦显著低于既往报道。在 AA 患儿中,全血细胞计数、骨髓细胞造血面积均 与疗效显著相关[29],但上述因素均与 RCC 患儿疗 效无关。
既往研究认为 RCC 患儿临床转归与非重型 AA 患儿相似,甚至好于 AA [18, 30]。本研究长期随 访结果显示,RCC 患儿的总体生存较非重型AA 差。 可能原因有:(1)既往研究中主要以重型 AA/ 超 重型 AA 作为 RCC 的对照组,而大多数 RCC 的起 病时的病情与非重型 AA 相当,本研究也显示 RCC 起病时除 Hb 和 HbF 外,其他临床指标较非重型 AA 无显著性差异。因此,重型 AA/ 超重型 AA 本 身相对较差的预后可能导致结果偏倚。(2)既往 大多数研究随访时间较短,可能未随访至 RCC 克 隆演变时间。本研究发现 54% 克隆演变发生于诊 断后 24 个月,因此随访时间长更有利于观察到两 者远期预后的差异性。
综上所述,目前以形态学为基础诊断的 RCC 具有临床意义。RCC 具有 MDS 的特征,与非重型 AA 患儿相比,总体生存较差,恶性转化率较高, CSA 治疗无效率较高。同时,需强调目前诊断的 RCC 仍具有异质性,未来研究应着力寻找克隆性 证据,为从发病机制上鉴别两种疾病提供依据。
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