2008 年WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类标 准^[1]将儿童骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）分为难治性血细胞减少（refractory cytopenia of childhood,RCC）、难治性贫血伴原 始细胞增高（refractory anemia with excess blasts, RAEB）、难治性血细胞减少伴原始细胞增高-转化型（refractory anemia with excess blasts in transformation,RAEB-t）。

RCC 是一个新提出的暂定分类，其诊断标准 为：持续的血细胞减少伴外周血原始细胞 <2%， 骨髓原始细胞 <5%，且一系病态造血比例大于 10% 或两系病态造血，并除外其他骨髓衰竭性疾 病及继发性 MDS ^[1]。这一亚型的提出是基于原始 细胞不高的儿童 MDS 具有一些与成人 MDS 不同的 临床特征，包括：成人 MDS 分类中的难治性贫血 伴环状铁粒幼细胞贫血，MDS 伴单纯 5q-在儿童 罕见^[2]；以单纯贫血（即成人的难治性贫血）起病 在儿童少见，多伴有中性粒细胞和（或）血小板 减少^{[3, 4]}；骨髓增生减低更常见。因此，成人“低危” MDS 的分类不适用于儿童 MDS 患者。

RCC 包含了骨髓增生重度减低伴轻度病态造 血的患儿和骨髓增生程度正常伴明显病态造血的 符合成人难治性血细胞减少伴多系病态造血的患 儿。骨髓增生减低的 RCC 与另一大类骨髓衰竭 性疾病—获得性再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA），特别是与非重型 AA 的鉴别诊断存在困难： 两者均表现为骨髓增生减低，病态造血不易识别， 无特定的免疫学和细胞遗传学标志。RCC 与非重 型 AA 均为慢性病程，需要长期随访才能判断两者 临床转归。从发病机制上讲，RCC 是一种恶性克 隆性疾病，有着潜在的向白血病转化的风险，而 非重型 AA 是一种主要由免疫介导的良性疾病，分 析两者的临床特征及转归，对临床治疗选择具有 重要的意义。本研究回顾性分析儿童 RCC 的临床 特征、疗效及临床转归，现报告如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象

研究对象为1990年1月至2013年6月我院 门诊及住院符合以下标准的患者：（1）年龄 0~14 岁之间；（2）初始诊断为非重型 AA；（3）初诊 时的骨髓细胞形态学及骨髓病理学资料均完整； （4）至我院前未进行治疗。

排除标准：（1）初始诊断为重型 AA/ 超重型 AA 的患者；（2）具有可疑的先天性骨髓衰竭的 体征或实验室检查结果，如肢体畸形和（或）丝 裂霉素断裂实验阳性和（或）单个细胞凝胶电泳 实验阳性；（3）有可疑的血液系统疾病和（或） 肿瘤家族史；（4）既往有化疗药物治疗史和（或） 放射线接触史；（5）怀疑继发于感染、维生素缺 乏或自身免疫病的血细胞减少。

非重型 AA 诊断标准参照文献^{[5, 6]}；重型及超 重型 AA 诊断标准参照文献^[6]。

该研究经中国医学科学院北京协和医学院血 液病医院血液学研究所伦理委员会批准。 1.2 骨髓形态学回顾性分析

患儿骨髓细胞形态学和骨髓组织病理学由 3 名专家重新评估。诊断流程及标准参考既往研 究^{[7, 8, 9, 10]}。骨髓细胞形态学、骨髓病理学样本根据 FAB（French-American-British Cooperative Leukemia Working Group）和 EWOG-MDS（the morphology group of the European Working Group MDS in children）标准 评估^{[11, 12]}。RCC 的诊断根据 WHO 2008 标准^[1]。骨 髓纤维化分级根据既往报道^[13]。 1.3 染色体核型分析

骨髓细胞染色体核型分析采用R显带技 术。异常染色体核型描述根据2009年ISCN （International System for Human Cytogenetic Nomenclature） 标准^[14] 和 IWGMC（International Working Group on MDS Cytogenetics）共识指南 ^[15]。 因骨髓增生减低本身会造成染色体核型分析成功 率低，本研究用至少 10 个中期分裂相替代原标准 中至少 20 个中期分裂相作为可分析的样本。≥ 2 个分裂相的相同的结构异常或染色体增加认为是 存在异常克隆。≥ 3 个分裂相相同的染色体缺失 认为是存在异常克隆。 1.4 诊断标准

阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）为至少 3 次 Ham 实验阳性或两系糖基磷脂酰肌醇锚蛋白 （GPI-AP）克隆缺失 >20% ，伴溶血的临床症状和 实验室检查证据（如血红蛋白尿、结合珠蛋白降 低、乳酸脱氢酶增高及尿胆红素增高）。PNH 克 隆采用流式细胞技术检测（抗-CD55 和抗-CD59）。 MDS 及 AML 的诊断及分型根据 WHO 2008 标准 ^[1]。 1.5 随访

随访方式为每 3~6 月一次门诊或住院复诊时 评估。所有患儿均在2013年6~7月电话随访一 次最新情况。随访终点为患儿死亡或2013年7月 30日。最终有130例RCC患儿可随访到临床转 归。失访率14%，中位随访时间为36个月（范围 1~283个月）。随访评估内容包括全血细胞计数、 骨髓细胞形态学、骨髓组织病理学、染色体核型 分析及血细胞 CD55/CD59 表达水平等。 1.6 疗效评价标准

参考文献标准判定疗效等级（表 1）^{[16, 17]}。必 须以至少连续两次、间隔至少 4 周全血细胞计数 结果来评估疗效。

表 1(Table 1)

表 1 非重型 AA 及 RCC 疗效标准

表 1 非重型 AA 及 RCC 疗效标准

所有统计学处理均应用 SPSS 17.0 统计软件完 成。非正态分布资料用中位数（范围）表示，组 间比较采用 Mann-Whitney U检验。总体生存采用 Kaplan-Meier 法估算，组间比较采用非参数检验。 多因素分析均采用 Cox 回归模型。P<0.05为差异 有统计学意义。 2 结果 2.1 RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征的比较

本研究共纳入 1 420 例既往诊断为非重型 AA 的患儿，最终经过骨髓细胞形态学和骨髓病理学 回顾性分析，152 例（10.70%）重新诊断为 RCC， 其余仍诊断为非重型 AA。RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征见表 2。与非重型 AA 相比，RCC 患 儿发病时 Hb 较低（P=00.001），胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin,HbF）较高（P=00.037）。

表 2(Table 2)

表 2 RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征的比较

表 2 RCC 患儿与非重型 AA 患儿临床特征的比较

骨髓细胞形态学和组织病理学分析显示 RCC 患儿红系、粒系和巨核细胞病态造血的比例分别 为 75.0%、53.9% 和 40.1%（巨核细胞系病态造血 通过 CD41 免疫组化染色确定）。RCC 患儿 1 系、 2 系、3 系血细胞病态造血的比例分别为 44.7%、 36.2%、19.1%，而非重型 AA 患儿仅有 12.1% 表 现为单纯红系的轻度病态造血。RCC 造血细胞面 积高于非重型AA（P<0.001）。22.4% 和 31.0% 的 RCC 患儿可见淋巴样小巨核细胞和异常红细 胞造血岛。轻度的纤维化（3.5%）和不成熟前体 细 胞 异 常 定 位（abnormal localization of immature precursors,ALIP）（1.1%）在 RCC 患儿中罕见， 在非重型 AA 患儿未见。 2.2 细胞遗传学分析

79 例 RCC 和 302 例非重型 AA 有可供分析的 染色体核型结果。RCC 患儿发病时染色体核型异 常的比例高于非重型 AA[21.5%（17/79）vs 8.3% （25/302），P=00.001]。RCC 异常染色体核型包括： 7 号染色体单体 23.5%（4/17）、8 号染色体三体 17.6%（3/17）、复杂核型 17.6%（3/17）和其他异 常 41.2%（7/17）。有 4 例（4/62，6.5%）发病时 染色体核型正常的 RCC 患儿病程中出现异常染色 体核型，分别为 1 例 46,XY,i（7q），1 例两个克 隆 47，XY，+8，t（8；21）（q22；q22），-12， del（20）（q11），+21 和 46，XY，del（20）（q12） 和 2 例单纯 8 号染色体三体（表 3）。

表 3(Table 3)

表 3 克隆演变 RCC 患儿的临床特征

表 3 克隆演变 RCC 患儿的临床特征

RCC患儿接受下列4种治疗方案之一： （1）仅观察及支持治疗（15.2%）；（2）仅雄激 素（包括安雄、达那唑及司坦唑醇）（16.0%）治疗； （3）仅环孢素（CSA）治疗（15.2%）； （4）CSA和雄激素联合用药（53.6%）。接受药 物治疗的RCC患儿总体CR、PR、NR率分别为 19.0%（20/105）、26.7%（28/105）、54.3%（57/105）。 3个不同药物治疗组间疗效比较差异无统计学意 义（P=00.849）。未经药物治疗的观察组和药物治 疗组间疗效比较差异无统计学意义（P=00.498）。 RCC 患儿 6 个月、12 个月、24 个月有效率（CR+PR） 分 别 为 16.7%（21/126）、26.0%（32/123）、 45.4%（44/97）。

6 例RCC 患儿在全血细胞计数进展至重型 AA/超重型AA水平时，接受了抗人T淋巴细胞免 疫球蛋白（ATG）联合CSA的强烈免疫抑制治疗 （IST），其中1例达CR，5例NR。3例患儿在 全血细胞计数进展至重型AA/超重型AA水平时 接受了造血干细胞移植。上述9例患儿未计入最 终的生存及白血病转化分析。 2.4 疗效预测因素

单因素分析表明患儿性别、年龄、诊断到开 始药物治疗的时间、治疗前 Hb、ANC、PLT 水平、 异常染色体核型、病态造血系别、骨髓造血细胞 面积与总 CR 率、总有效率均无相关性。多因素分 析未发现与总 CR 率、总有效率相关的独立因素。 2.5 复发

至随访终点，36.1%（44/122）RCC 患儿停药。 其中 25%（11/44）RCC 患儿停药后复发。除 1 例 患儿复发前有上呼吸道感染外，其余均无诱因。 停药后复发的中位时间为停药后 6.5 个月（范围 1~87 个月）。停药后复发的 11 例 RCC 患儿中， 3 例用原方案治疗仍有效。停药后复发与治疗方 案、CSA 疗程、雄激素疗程及 CSA 减量时间均无 关。Kaplan-Meier 法估计停药后 2 年累计复发率为 28.4%。11.5%（14/122）的患儿为治疗过程中复发 （即失去原来的 CR 或 PR），其中 3 例复发前有 上呼吸道感染，1 例伴 PNH，1 例伴染色体核型异 常，余均无诱因（表 3）。 2.6 总体生存及克隆演变分析

与非重型AA相比，RCC患儿总体生存较差 （P=00.032，图 1），5年和10年的预期生存率分 别为87.9%和72.4%，非重型AA分别为93.8%和 85.7%。本研究中克隆演变包括3种情况：急性白 血病、PNH和新出现的染色体异常，对非重型AA 患儿还包括MDS。至随访终点，RCC患儿克隆演 变率为10.0%（13/130）（表 3）。与非重型AA相比， RCC患儿克隆演变的风险较高（P<0.001，图 2）， RCC患儿5年和10年的预期克隆演变率分别为 15.3%和20.0%，非重型AA患儿为0.8%和2.7%。 与非重型AA相比，RCC患儿病程中新出现染色 体核型异常的风险较高（P<0.001，图 3），RCC 患儿2年预期出现新的染色体异常率为3.6%，非 重型AA患儿为0.2%。RCC和非重型AA患儿10 年的预期PNH进展率分别为0.5%、0.3%，两者比 较差异无统计学意义（P=00.396）。RCC患儿5年 和10年预期白血病转化率为10.0%和20.0%，非 重型AA患儿为0.2%和1.2%，与非重型AA相比， RCC患儿白血病转化的风险较高（图 4）。

图 1 非重型 AA 和 RCC 总体生存情况 与非重型 AA（NSAA）相比，RCC 患儿总体生存较差，5 年和 10 年的预期 生存率分别为 87.9% 和 72.4%，非重型 AA（NSAA）分别为 93.8% 和 85.7%。

图 2 非重型 AA 和 RCC 总体总体克隆演变情况 与非重型 AA（NSAA）相比，RCC 患儿克隆演变的风险较高， RCC 患儿 5 年和 10 年的预期克隆演变率分别为 15.3% 和 20.0%， 非重型 AA（NSAA）患儿为 0.8% 和 2.7%。

图 3 非重型 AA 和 RCC 出现新的核型异常的克隆演 变情况 与非重型 AA（NSAA）相比，RCC 患儿病程中新出现 染色体核型异常的风险较高，RCC 患儿 2 年预期出现新的染色体 异常率为 3.6%，非重型 AA（NSAA）患儿为 0.2%。

图 4 非重型 AA 和 RCC 向白血病转化的克隆演变 情况 与非重型 AA（NSAA）相比，RCC 患儿白血病转化的 风险较高，RCC 患儿 5 年和 10 年预期白血病转化率为 10.0% 和 20.0%，非重型 AA（NSAA）患儿为 0.2% 和 1.2%。

单因素分析表明发病时具有下列因素与 RCC 患儿总体生存率不良相关：Hb<90 g/L（P=00.022）、 ANC<1.2×10⁹/L（P=00.006）、 发 病 时 染 色 体 核 型异常（P=00.011）、不良核型（涉及 7 号染色 体的异常核型或复杂核型）（P=00.011）、治疗 前 HbF ≤ 0.025（P=00.003）、骨髓 PAS 染色阳性 （P=00.049）。接受不同药物治疗方案的 RCC 患儿 总体生存率和白血病转化率差异无统计学意义； 接受支持治疗与药物治疗 RC 患儿总体生存率和白 血病转化率差异亦无统计学意义。 3 讨论

RCC 是2008 年WHO 造血与淋巴系统肿瘤 诊断分型标准对儿童 MDS 暂定的分类。RCC 是 儿童 MDS 最常见的类型，约占儿童 MDS 患者的 50% ^[1]。目前，对于这一以形态学为基础诊断的类 型尚有争议，原因在于：既往研究报道 RCC 具有 与 AA 相似的临床特征、对 IST 的疗效和临床转归 亦相似^{[18, 19]}；一部分先天性骨髓衰竭与 RCC 骨髓 形态相似^{[20, 21]}；全基因组测序发现 RCC 和儿童非 重型 AA 均表现为突变基因较少，两者在单个样本 平均突变数和具体突变基因上无显著性差异^[19]。 因此，这种基于形态学的疾病分类的意义受到了 质疑。既往研究着重于 RCC 与重型 AA/ 超重型 AA 的比较，且随访时间较短。大多 RCC 患儿骨 髓增生程度较重型 AA/ 超重型 AA 轻，全血细胞 计数水平更接近于非重型 AA。非重型 AA 和 RCC 均表现为慢性病程，随访时间足够长才能获得准 确的临床转归。

本研究发现 RCC 患儿外周血 Hb 水平较低， 但骨髓增生程度正常甚至较活跃，特别是红系增 生较活跃，表现为红系比例增高、异常红系造血 岛及显著红系病态造血，因此 RCC 患儿具有无效 造血的特点。既往报道的较高的骨髓造血细胞面 积与非重型 AA 预后良好有关不同^[22]，本研究中 较高的骨髓造血细胞面积与 RCC 患儿的疗效及总 体生存无关，提示骨髓衰竭程度与 RCC 预后无关。

RCC 患儿具有克隆性造血的特点。与既往报 道非重型 AA 患儿相比^{[18, 19, 22]}，RCC 患儿起病时染 色体核型异常率较高，随着病程进展，克隆演变 率亦较高，尤其是向恶性克隆转化的风险较高。 分析表明非重型 AA 中向白血病转化的患儿可能与 治疗相关，如长期应用 G-CSF，多次强烈 IST 及相 继接受 ATG 及 CTX 治疗等。而 RCC 患儿中转化 为白血病者与具有 7 号染色体异常或复杂染色体 核型有关，与治疗无关。提示 RCC 本身具有较高 的向白血病转化的风险。另一方面，RCC 患儿向 PNH 转化率低。既往研究认为 AA 患者出现 PNH 克隆演变的发病机制主要是免疫异常导致的在骨 髓衰竭背景上的 PNH 克隆细胞免疫逃逸^{[23, 24, 25, 26]}。与 既往研究一致^[27] ，本研究中部分 RCC 患儿对 IST 亦有效，提示部分患儿发病与免疫异常有关。上 述结果提示，依据形态学诊断的 RCC 虽然具有可 操作性，但对探寻疾病的本质尚存局限性。

既往研究结果表明，输血依赖和（或）粒细 胞小于 1.0×10⁹/L 的 RCC 对 IST 疗效与重型 AA 或超重型 AA 相似^[28]。本研究结果与之有所不同， RCC 患儿对以 CSA 为主免疫抑制剂反应较非重型 AA 差，完全缓解率低。进展至重型 AA 或超重型 AA 时，行 IST 的有效率亦显著低于既往报道。在 AA 患儿中，全血细胞计数、骨髓细胞造血面积均 与疗效显著相关^[29]，但上述因素均与 RCC 患儿疗 效无关。

既往研究认为 RCC 患儿临床转归与非重型 AA 患儿相似，甚至好于 AA ^{[18, 30]}。本研究长期随 访结果显示，RCC 患儿的总体生存较非重型AA 差。 可能原因有：（1）既往研究中主要以重型 AA/ 超 重型 AA 作为 RCC 的对照组，而大多数 RCC 的起 病时的病情与非重型 AA 相当，本研究也显示 RCC 起病时除 Hb 和 HbF 外，其他临床指标较非重型 AA 无显著性差异。因此，重型 AA/ 超重型 AA 本 身相对较差的预后可能导致结果偏倚。（2）既往 大多数研究随访时间较短，可能未随访至 RCC 克 隆演变时间。本研究发现 54% 克隆演变发生于诊 断后 24 个月，因此随访时间长更有利于观察到两 者远期预后的差异性。

综上所述，目前以形态学为基础诊断的 RCC 具有临床意义。RCC 具有 MDS 的特征，与非重型 AA 患儿相比，总体生存较差，恶性转化率较高， CSA 治疗无效率较高。同时，需强调目前诊断的 RCC 仍具有异质性，未来研究应着力寻找克隆性 证据，为从发病机制上鉴别两种疾病提供依据。