急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一组在临床及细胞遗传学上均具有高度 异质性的疾病，具有多种遗传性缺陷^[1]。初诊时的 细胞遗传学（染色体核型分析）检测结果已经作为AML 的重要的预后因素^[2]。研究发现，除了遗 传学的改变之外，表观遗传学在肿瘤发生的过程 中也起到了重要作用^[3]。越来越多的研究表明， DNA 甲基化状态异常尤其是抑癌基因的高甲基化 失表达在白血病的发生发展、诊断、检测微小残 留病、预测病情以及指导治疗方面都有重要的作 用^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}。

9 号染色体短臂21 段（9P21）的异常在多 种肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。目前 已经发现在9P21 区段有P14/ARF、P16/INK4A、 P15/INK4B 等抑癌基因，它们的位置非常临近，并 且有部分重叠，构成了一个重要的抑癌基因簇。 通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4 和6（cyclindependent kinases 4 and 6） 的活性，使细胞周期 停滞于G1/S 期，对细胞周期起着负性调控作用 ^{[9, 10]}。范丽萍等^[11] 采用巢式甲基化特异性聚合酶 链反应法观察了82 例急性白血病患者中P16 基 因甲基化，结果显示P16 基因高甲基化发生率为 39.0%； 在成人AML 中，有50%~80% 的患者可 以检测到CDKN2B 基因（P15） 甲基化^{[8, 12]}。关 于AML 中基因甲基化的研究在国内外已经较多， 然而多是成人AML 的研究，在儿童AML 中的研 究相对较少。为了解我国儿童AML 中P14/ARF、 P16/INK4A、P15/INK4B 基因甲基化的情况，本研 究应用甲基化特异性- 多重连接酶依赖性探针扩增 法（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA） 对58 例初诊AML 患儿进行9P21 区段P14/ARF、P16/INK4A、 P15/INK4B 基因甲基化的研究，并分析其与临床特 征、疗效及预后的相关性，报告如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象

收集2010 年4 月至2012 年12 月我院儿科收 治的58 例初诊为AML 的住院患儿的临床资料并 进行回顾性分析，包括临床特征、FAB 分型及细 胞遗传学改变等。所有患儿均经骨髓形态学、细 胞组织化学染色、细胞免疫分型及细胞遗传学确 诊。另选取38 例健康志愿儿童作为正常对照。本 研究获得AML 患儿及健康儿童志愿者监护人的知 情同意。 1.2 治疗方案

（1）急性早幼粒细胞白血病（APL，AMLM3） 患儿治疗方案： 应用全反式维甲酸 （ATRA，每日25 mg/m²，连续使用42 d）联合三 氧化二砷（As₂O₃，每日0.15~0.2 mg/kg，连续使 用28 d）行诱导治疗达完全缓解（CR）后，给予 去甲氧柔红霉素（IDA，每日10 mg/m²，连续使用 3 d），再予As₂O₃（每日0.15~0.2 mg/kg，连续使 用28 d）行强化治疗。上述治疗结束后随机分为 两组，分别予柔红霉素（DNR，每日45 mg/m²） 或DNR（ 每日45 mg/m²）+ 阿糖胞苷（Ara-C， 每12 h 1 000 mg/m²），每疗程均连续使用3 d， 连用2 个疗程。维持治疗期采用ATRA（ 每日 20 mg/m²，1~14 d） 联合6- 巯基嘌呤（6-Mp，每 日100 mg/m²，15~28 d） 和甲氨蝶呤（MTX，每 日20 mg/m²，15 d 和22 d）进行治疗，共维持治 疗2 年。缓解期行腰穿和地塞米松（4 mg）+Ara-C （36 mg）+MTX（12 mg）的三联鞘注4 次。

（2）非AML-M3 患儿治疗方案：该组患儿采 用AML-99 方案进行化疗，详见文献^[13]。 1.3 基因组DNA 提取

取AML 患儿和健康儿童志愿者骨髓液或 外周血2 mL，采用DNA 提取试剂盒（Axygen Biosciences 公司，美国）提取基因组DNA，-20℃ 保存备用。 1.4 MS-MLPA 法行甲基化检测

所用试剂盒购于荷兰MRC-Holland 公司 （ME024-B1），具体操作步骤如下：（1）DNA 变性： 取5 μL（20 ng/μL）DNA 样品，98 ℃ 处理 5 min，25℃暂停。（2）探针与DNA 的杂交：取 出样品，降至室温，加入3 μL 杂交混合液（1.5 μL SALSA probemix+1.5 μL MLPA 缓冲液），95℃处 理1 min，60℃温浴16~24 h。（3）连接及连接- 消化：PCR 仪降到20℃，取出PCR 管；每管加 入3 μL ligase buffer A 和10 μL 水，吹打混匀；每 个标本分为a、b 两管，各取10 μL 混合液到新的 PCR 管；将所有管放回PCR 仪，48℃暂停；往a 管中加入10 μL 连接酶混合液（8.25 μL 水+1.5 μL ligase buffer B+0.25 μL ligase-65 酶），混匀，往 b 管中加入10 μL 连接酶- 消化混合液（7.75 μL 水+1.5 μL ligase buffer B+0.25 μL ligase-65 酶+0.5 μL HhaI 酶），混匀；48℃温浴30 min 连接消化；98 ℃ 加热5 min 灭活酶；20 ℃ 暂停。 （4）接探针的PCR 扩增：从PCR 仪中取出样品， 降至室温；加入10 μL PCR 混合液（7.5 μL 水+2 μL PCR Primer Mix+0.5 μL SALSA Polymerse） 行PCR 扩增，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35 个循环后，72℃再延伸20 min，15℃暂停。 （5）PCR 产物的毛细管电泳：取0.5 μL PCR 产物， 加入0.5 μL 500LIZ® Size Standard 和9 μL Hi-DiTM Formamide 行毛细管电泳。（6）结果分析：所得 结果通过GeneMapper 4.0 和Coffalyser 软件进行半 定量分析，了解目的基因的片段缺失或扩增情况。

该MS-MLPA 试剂盒中，包含9 个甲基化检测 探针，可检测CDKN2A（P14/ARF、P16/INK4A）、 CDKN2B（P15/INK4B）基因启动子区域的甲基化 状态。各探针的详细情况见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 MS-MLPA 试剂盒中甲基化特异性探针列表

表 1 MS-MLPA 试剂盒中甲基化特异性探针列表

随访时间截止至2013 年12 月20 日或失访日 期，中位随访时间为16 个月（1~45 个月）。无事 件生存（EFS）期定义为自诊断到第1 次事故（包 括分子生物学和临床复发、在CR 期间的死亡）或 末次随访日期；无病生存（DFS）期定义为自CR 至白血病复发或在CR 期间死亡或末次随访日期。 总生存（OS）期指自诊断到死亡或末次随访日期。 1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以中位数（范围）表示，组间比较采 用秩和检验；计数资料用百分率（%）表示，样本 率的比较采用χ² 检验。生存分析应用Kaplan-Meier 法和log-rank 检验。p<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 AML 患儿的一般资料

58 例AML 患儿中，男36 例（62%），女 22 例（38%），中位年龄8 岁（1~13 岁）。中位 初诊白细胞数为17.3×10⁹/L（0.8~504.8×10⁹/L）， 中位初诊血红蛋白为85 g/L（43~134 g/L），中位 初诊血小板数为44×10⁹/L（9~228×10⁹/L）。 2.2 MS-MLPA 法行甲基化检测结果

在健康儿童中各探针均未发现甲基化。在 AML 患儿中，157 bp 探针、427 bp 探针和171 bp 探针未检测到甲基化；检测到CDKN2A 基因的甲 基化包含136 bp 探针和237 bp 探针； CDKN2B 基 因的甲基化涉及130 bp 探针、210 bp 探针、220 bp 探针和417 bp 探针。 2.2.1 甲基化特异性探针检测结果与临床特征、预后的关系

在44 例（76%）AML 患儿中检测到 至少1 个探针的甲基化，37 例（64%）AML 患儿 中检测到至少2 个探针的甲基化。依据每一个探 针的检测结果分为非甲基化组和甲基化组。各探 针非甲基化组和甲基化组之间进行比较后发现， 136 bp 探针甲基化组患儿的血红蛋白水平[123.5 g/L （113~134 g/L）] 高于非甲基化组[84 g/L（43~127 g/L）] （p=0.026），130 bp 探针甲基化组患儿的血小板 水平[38×10⁹/L（9~160×10⁹/L）] 低于非甲基化组 [75×10⁹/L（30~228）×10⁹/L]（p=0.029），417 bp 探针甲基化组患儿的男性比例高于非甲基化组 （p=0.003）。不同FAB 分型AML 患儿各探针甲基 化百分比情况见表 2，只有130 bp 探针在不同FAB 分型患儿中甲基化的比例有明显的差异（p=0.034）。 各探针的非甲基化组和甲基化组的EFS、DFS 和OS 率之间差异均无统计学意义，然而220 bp 探针甲基 化组的DFS 和EFS 率相比非甲基化组有降低趋势。 患者年龄与患者甲基化探针数目之间无明显的相 关性；患儿高甲基化的探针数目与其EFS、DFS 及 OS 率之间无明显的相关性。

表 2(Table 2)

表 2　不同FAB 分型AML 患儿CDKN2A 与CDKN2B 基因甲基化发生率　[例（%）]

表 2　不同FAB 分型AML 患儿CDKN2A 与CDKN2B 基因甲基化发生率　[例（%）]

AML 患儿中， CDKN2A 的甲基化率仅为5%，而CDKN2B 的甲 基化较为常见，各探针甲基化率为76%。AML-M3 和AML-M4 的CDKN2B 甲基化发生率为100%。 随访结束时3 例AML-M3 患儿均无病生存；7 例 AML-M4 患儿中，4 例为M4eo（CBFB/MYH11 阳性）， 1 例放弃治疗，3 例复发。 2.2.3 基因甲基化与细胞遗传学结果之间的关系

46 例患儿进行细胞遗传学检测，1 例未见分裂 像。按照文献^[2] 所述，依据细胞遗传学结果将45 例患儿分为预后良好组（n=27），其中t（8；21） 21 例，t（15；17）3 例，inv16（CBFB/MYH11）3 例； 预后中等组（n=11）和预后不良组（n=7）。上述 3 组中均有基因甲基化，预后良好组患儿发生甲 基化24 例（89%），预后中等组患儿发生甲基化 7 例（64%），预后不良组患儿发生甲基化5 例 （71%），三组间比较差异无统计学意义（p=0.174）。 3 讨论

AML 是一种克隆性起源于髓系多能干细胞 或很早期的祖细胞突变而引起的造血系统恶性肿 瘤。近半数AML 患者存在细胞遗传学异常，细胞 遗传学正常的患者，可存在其他的体细胞突变， 影响患者的预后^[14]。除了遗传学改变之外，表观 遗传学在肿瘤发生中也起到了重要的作用^[3]。基 因的甲基化在表观遗传学的研究中也越来越引起 重视。富含CG 的区域，即CpG 岛多位于基因启 动子区，并且一般在健康组织中为非甲基化^{[4, 15, 16]} 状态。这些基因的启动子区的甲基化常会导致基 因的转录沉默，是肿瘤发生过程中基因沉默的重 要机制之一^{[4, 12]}。其中最常研究的是CDKN2B 基 因（P15/INK4B）和与它功能类似的CDKN2A 基 因（包含很多转录变体：亚型1，P16/INK4A；亚 型4，P14/ARF）^[17]。本研究应用MS-MLPA 方法 对58 例初诊儿童AML 的9P21 区域的CDKN2A 和 CDKN2B 基因进行甲基化检测，发现CDKN2A 的 甲基化率仅为5%，而CDKN2B 的甲基化较为常见， 占76%。

Galm 等^[7] 的研究认为基因甲基化与OS 及初 诊时的白细胞计数无关。而本研究中发现，部分 探针甲基化与初诊时的性别、白细胞和血小板计 数有关。其原因可能与不同的实验方法、不同年 龄阶段等有关，需要进一步扩大样本量进行深入 研究。

有研究认为，约50%~60% 的APL 患者发生 P15 启动子区的甲基化，并且在未联合应用As₂O₃ 时，P15 启动子区的甲基化为预后不良的因素^[18]。 当复发APL 患者应用As₂O₃ 治疗之后，P15 甲基化 不影响预后^[19]。在本研究的APL 患者中，P15 甲 基化率为100%，与既往报道文献并不完全一致， 可能与不同的检测方法、年龄及样本量小有关。 同时，本研究中的3 例P15 甲基化患儿均长期无 病生存，可能与应用含有As₂O₃ 的治疗方案有关。 相似的，Markus 等^[20] 的研究中，inv（16）的P15 平均甲基化水平为4.6%（2%~11%），远低于本 研究中AML-M4 患儿中P15 甲基化率（100%）， 亦可能与不同的检测方法、年龄差别有关。

Cechova 等^[12] 也应用了MS-MLPA 方法检测 9P21 区域甲基化的情况，其中13 例成人AML 的 P15 的甲基化率为100%，P14 甲基化率为62%， P16 甲基化率为46%。国内范丽萍等^[11] 研究成 人AML，P16 基因甲基化率为39%。本研究中， P15 甲基化率与成人的相似，而P14 和P16 的甲 基化率则明显低于成人，其原因可能与研究样本 的年龄差异有关。有研究表明，在AML 中存在 IDH1/2、DNMT3A、TET2 等基因的重现性突变， 这些基因编码的蛋白质参与了表观遗传学途径， 破坏胞嘧啶共价修饰的平衡可能是髓系白血病发 病的关键步骤^{[4, 5]}。然而，众所周知，儿童AML 中IDH1/2、DNMT3A、TET2 的突变率极低，与成人 存在明显差异^{[21, 22]}。这提示，儿童AML 的发病可 能存在其他机制。基于成人与儿童具有相似的P15 甲基化发生率，同时，在MDS 中，P15 甲基化的 发生率会随着疾病进展到AML 而明显增加^{[12, 23]}， 因而我们推测：通过对P15 甲基化相关的通路进 行研究可能发现儿童与成人AML 的共同发病机制。

众所周知，DNA 甲基化在AML 的发病中起 到一定的作用，而DNA 的甲基化过程是可逆的， DNA 甲基化转移酶是甲基化过程中关键的一环。 已有文献表明，DNA 甲基化转移酶抑制剂在AML 的治疗中是安全有效的^[24]。遗憾的是本研究中的 病例尚无应用该类药物的经验。此外，本组患儿 不同FAB 分型组别间样本含量差别较大，如M3 型组仅3 例，且总体样本量偏小，可能对结果有 一定的影响，需要进一步扩大样本量进行深入研 究。加强儿童AML 中基因甲基化的基础和临床方 面的研究是我们努力的方向。