支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿最常见的并发症，已经成为新生儿 重症监护病房最棘手的问题之一。虽然 BPD 的发 病机制不完全清楚，但新生肺暴露在高氧环境中 通过氧毒作用所致的肺损伤是重要的原因之一 ^[1]。 国内外研究表明高浓度氧所致的氧化应激损伤在 BPD 的发生和发展中起着极其重要的作用 ^{[2, 3]}。目 前缺乏有效的治疗方法。

近年来发现 I 型肺泡上皮细胞参与肺水肿形 成、肺泡及间质纤维蛋白沉积，并影响急性肺损 伤与急性呼吸窘迫综合征的转归 ^[4]。晚期糖基化 终末产物受体（receptor for advanced glycation endproducts,RAGE）是一种多配体受体，属于细胞表 面分子免疫球蛋白超家族成员，RAGE 位于 I 型肺 泡上皮细胞基底侧细胞膜，是其损伤标志物 ^[4]。 RAGE 有两种形式：第一种为全长 RAGE，又称膜 RAGE，包括膜外域、跨膜域和膜内域；第二种是 可溶性 RAGE（sRAGE），缺乏跨膜域，被释放到 细胞外和血浆中，可作为潜在的 I 型肺泡上皮细胞 损伤标志物，循环中 sRAGE 水平增高与急性肺损 伤及急性呼吸窘迫综合征的严重程度相关 ^[5]。本课 题组前期研究表明 RAGE-NF-κB 通路在高氧诱导 的肺损伤中具有重要作用，通过下调 RAGE-NF-κB 通路对肺损伤产生保护作用 ^[6]。因此，RAGE-NF- κB 通路在 BPD 的发病机制中逐渐受到关注。

临床上糖皮质激素广泛应用于新生儿 BPD 的 治疗，系统激素治疗虽可改善不能撤机患儿肺功 能、降低对氧的依赖性、促进拔管和缩短机械通 气时间，但因其作用机制仍不明确，目前仍存在 较多争议。本研究将在前期研究基础上，研究糖 皮质激素对高氧诱导肺损伤时 RAGE-NF-κB 信号 通路的影响，从而探讨激素治疗 BPD 相关机制。

TRIzol（美国 Invitrogen 公司）；反转录 - 聚 合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（大连 TaKaRa 公 司）；抗 RAGE 单克隆抗体（英国 Abcam 公司）； 抗 NF-κB 抗体及抗 β- 肌动蛋白抗体（美国 Sigma 公司）；ELISA 试剂盒（武汉博士德公司）；CY- 100 数字测氧仪（浙江省建德市利达仪器厂）。所有引物由上海生物工程公司合成。

日龄 1 d 新生 Sprague-Dawley 大鼠 24 只，雌 雄不限，体重 10~15 g，由南京医科大学动物实验 中心提供。按随机数字表法将 24 只新生大鼠随机 分为空气对照组、高氧模型组和激素干预组，各 组 8 只。按本实验室方法新生大鼠于生后即置于 95% 氧浓度下暴露 7 d 制成模型 ^[7]，空气对照组仅 生后暴露于同室内空气中饲养 7 d，激素干预组于 造模后尾静脉注射地塞米松 1 mg/kg，隔天 1 次， 共 3 次，高氧模型组及空气对照组动物均同时尾 静脉注射相同体积的生理盐水。3 组喂养新生大鼠 的母鼠每 24 h 互换，以避免母鼠因氧中毒影响新 生鼠的哺乳，记录大鼠生长情况。

各组大鼠均于实验第 13 天称重后，腹腔注 射 10% 水 合 氯 醛（8 mL/kg） 处 死； 采 用 眼 球 放 血法留取血 1~2 mL；切断腹主动脉进一步放血。 颈正中暴露气管，剪开一小口插入导管并固定， 向导管内缓缓注入 1 mL 预冷生理盐水反复回抽 3 次，回收率 80%~90%，留取支气管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。快速剪开胸 腔，取出双侧肺脏，肉眼观察后，生理盐水冲洗； 左上肺制成肺组织匀浆，右上肺组织以 4% 多聚甲 醛固定，石蜡包埋后连续切片，厚度为 6 μm，供 免疫组化和组织学检查用。

采血后室温下静置 2 h，再置 4℃冰箱 3~4 h， 待血液凝固血块收缩后，4 000 rpm 离心 10 min， 取上清，保存于 -20℃冰箱中。取 BALF 于 1 h 内 4 000 rpm 离心 10 min，取上清，保存于 -20℃冰箱 中。采用 ELISA 法完全按试剂盒说明书检测血清 及 BALF 中 TNF-α 和 sRAGE 含量。

应 用 TRIzol 试 剂 常 规 一 步 法 提 取 肺 组 织 标 本 总 mRNA。RAGE 引 物 序 列： 上 游： 5'-GGTGCTGGTTCTTGCTC-3'，下游：5'-TCCCTCG- CCTGTTAGTT-3'，扩增产物长度为 235 bp； NF-κB 引物序列：上游 5'-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3'， 下游 5'-TCCGGAACACAATGGCCAC-3'，扩增 产物长度 398 bp；内参 β-actin 引物序列：上游：5'-GATGACAAGCAGCCCTAT-3'，下游： 5'-TCCATGCCAATTTACAAC-3'，扩增产物长度 450 bp。取 PCR 产物 5 μL 在 1.5% 琼脂糖凝胶上 电泳，在凝胶成像系统中分别计算 RAGE mRNA、 NF-κB mRNA 与 β-actin 的灰度值比值即代表 RAGE mRNA 和 NF-κB mRNA 相对表达量。

肺 组 织 匀 浆 10 000 rpm 离 心 10 min 后，取 上清测蛋白浓度，加上样缓冲液并于沸水中煮沸 5 min 后以 10% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分 离，然后把胶上的蛋白电转移到醋酸纤维膜上，5% 无脂奶粉封闭，与待测蛋白的特异性抗体（稀释 度均为 1 : 500）孵育杂交，4℃过夜洗膜后，再加 辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 1 h，洗膜 后进行显色，曝光于 X 线胶片上，在图像分析系 统分别计算目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的 比值代表目的蛋白的相对表达量。

苏木精-伊红染色后检测肺组织病理学改变， 按文献 ^[8] 的方法，光镜下依据肺泡间隔水肿、肺 泡出血、肺泡内纤维蛋白沉积和肺泡内细胞浸润 4 方面进行肺损伤病理学评分，每个方面分别计 0~3 分；每只大鼠分别切取 4 张切片，每张切片观察 不重叠的 10 个视野，分别记录病理学评分的值， 4 张切片的平均值即代表该大鼠的病理学评分。

采用 SPSS 13.0 统计学软件对所有数据进行统 计学比较分析，计量资料以均数 ± 标准差（x± s） 表示，多组间比较采用 One-way ANOVA 分析，组 间两两比较采用 LSD-t 检验，P<0.05 为差异有统 计学意义。

高氧模型组和激素干预组新生鼠活动逐渐减 少，反应迟钝，但全部成活；激素干预组较高氧 模型组上述情况有所改善。

空气对照组大鼠肺组织结构完整，基本无 炎性细胞渗出；高氧模型组可见炎性细胞渗出、 肺泡间隔水肿增厚；而激素干预组水肿、炎性细 胞浸润以及出血等病理情况均较高氧模型组减轻 （图 1）。3 组肺组织损伤评分差异有统计学意义 （ F=37.68，P<0.01），其中高氧模型组肺组织损 伤评分（3.3±0.7）高于空气对照组（0.7±0.4） 和激素干预组（1.1±0.4），且激素干预组肺组织 损伤评分亦高于空气对照组（均 P<0.05）。

图 1 各组大鼠肺组织病理切片（苏木精 - 伊红染色，×100）对照组大鼠肺组织结构完整，基本无炎性细胞渗出；高氧模型组可见大量炎性细胞浸润、出血和肺泡壁水肿增厚；激素干预组上述病理情况均较高氧模型组有所减轻。

ELISA 检测结果显示 3 组间血清中 TNF-α 和 sRAGE 水平的差异有统计学意义（均 P<0.01）； 高氧模型组和激素干预组明显高于对照组，而激 素干预组明显低于高氧模型组（均 P<0.05）。

同时 3 组大鼠间BALF中TNF-α、sRAGE 水 平的差异有统计学意义（均 P<0.01）；高氧模型 组和激素干预组 TNF-α 明显高于对照组，sRAGE 低于对照组，而激素干预组 TNF-α 明显低于模型 组，sRAGE 高于模型组（均 P<0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组新生大鼠血清和 BALF 中 TNF-α 和 sRAGE水平比较（x± s）

表 1 各组新生大鼠血清和 BALF 中 TNF-α 和 sRAGE水平比较（x± s）

RT-PCR 检测结果显示，3 组间肺组织 RAGE mRNA、NF-κB mRNA 表达差异均有统计学意义 （均 P<0.05）；高氧模型组和激素干预组明显高 于对照组，而激素干预组明显低于高氧模型组（均 P<0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组新生大鼠肺组织 RAGE mRNA 和 NF-κBmRNA 的表达比较（x± s）

表 2 各组新生大鼠肺组织 RAGE mRNA 和 NF-κBmRNA 的表达比较（x± s）

Western blot 结果显示，3 组间肺组织 RAGE、 NF-κB（NF-κB p65）蛋白表达差异均有统计学意 义（均 P<0.01），高氧模型组和激素干预组明显 高于对照组，而激素干预组明显低于高氧模型组 （均 P<0.05），见图 2。

图 2 各组大鼠肺组织 RAGE 和 NF-κB 蛋白水平表达A 为 Western blot 电泳条带图；B~C 为蛋白相对表达量统计图，a 示与空气对照组相比，P<0.05；b 示与高氧模型组相比，P<0.05。

随着辅助机械通气的广泛应用及肺表面活性 物质的问世，早产儿，特别是超低出生体重儿的 存活率明显得到了提高，随之 BPD 的发病率也逐 年增加。研究认为肺泡发育障碍是其主要的病理 改变，其发病机制与肺发育不成熟、高浓度氧、 感染、呼吸机相关性肺损伤和细胞凋亡等有关 ^{[9, 10]}。

RAGE 的生理作用与肺泡气体交换、细胞铺 展、细胞增殖以及细胞外基质黏附等有关 ^[11]。病 理状态下，细胞膜上的 RAGE 与配体结合后可启 动多条信号通路，其中以 NF-κB 通路最为重要。 RAGE-NF-κB 通路激活及随后多种促炎症因子的 转录是一种正反馈环，它通过一种正向的对基因 启动子的直接调控增加 RAGE 基因在细胞表面的 表达，使细胞持续活化，最终导致组织细胞的损 害 ^[12]。研究表明肺泡中 sRAGE 水平可作为 I 型肺 泡上皮细胞损伤的标志，评价肺损伤的严重性和 评估疗效 ^[13]。Lizotte 等 ^[14] 发现肺组织中 RAGE 含 量随肺组织成熟度增加而逐渐升高，高氧可抑制 RAGE 表达；并认为这可能与高氧抑制肺泡发育 致Ⅰ型肺泡上皮细胞数量下降有关，而支气管肺 发育不良的病理损伤程度可能与 sRAGE 的丧失或 sRAGE/RAGE 的比例失衡有关。

系统激素治疗 BPD，可改善不能撤机患儿肺 功能、降低对氧的依赖性、促进拔管和缩短机械 通气时间，对治疗 BPD 有较好的疗效。此外，糖 皮质激素能促进肺表面活性物质的合成及肺抗氧化酶的生成，能减少肺水肿和炎症反应，减少炎 性细胞的浸润，抑制纤维细胞的增生 ^{[15, 16]}，但其 机制仍不明确。

本研究发现，应用糖皮质激素干预后，肺组 织 RAGE、sRAGE、NF-κB 蛋 白 及 mRNA 表 达 明 显降低，血清中 sRAGE 含量明显升高。由此，我 们认为高氧可启动 RAGE-NF-κB 信号通路，从而 引起肺的损伤，而糖皮质激素治疗后可抑制 RAGE 及其可溶性形式，减少促炎症因子的表达，从而 破坏 RAGE-NF-κB 通路的正反馈环，下调这一信 号通路从而发挥肺保护作用。sRAGE 具有阻断 RAGE 信号、保护组织和细胞免受配体相关性损伤 的能力，其发挥诱饵受体作用，与肺损伤密切相 关。有实验研究发现，肺泡中 sRAGE 水平可作为 I 型肺泡上皮细胞损伤的标志物，评价损伤的严重 性和疗效评估 ^[17]。而在成人研究中 sRAGE 与慢性 肺疾病肺功能密切相关 ^[18]。故我们推测 sRAGE 的 水平亦可能作为监测 BPD 肺损伤程度及评价预后 的指标。

综上所述，糖皮质激素可通过下调 RAGE-NF- κB 通路，从而发挥保护肺组织，治疗 BPD 的作用。