支气管哮喘（简称哮喘）是气道慢性炎症性 疾病，其特点为气道可逆性阻塞和气道高反应性。 核因子-κB（NF-κB）是一种广泛存在于体内的多 种细胞的核转录因子，参与多种炎症相关因子的 基因转录。抑制 NF-κB 的活化，进而阻断炎症因 子的产生途径，可达到减轻哮喘气道炎症的目的。

糖皮质激素（GC）是目前公认治疗哮喘最有 效的药物。吸入性 GC 主要作用在气道的上皮细胞， 在细胞水平，GC 通过抑制趋化因子和黏附分子的 生成来阻断炎症细胞向气道募集，从而减少气道炎 症细胞的数量。在基因水平，GC 能够促进抑制蛋 白 I κB-α表达上调，抑制 NF-κB 依赖基因的转录 ^[1]。 本研究拟通过建立哮喘小鼠模型，探讨布地奈德 （Budesonide,BUD）雾化吸入治疗哮喘小鼠的机制。 1　材料与方法 1.1　主要试剂及仪器

BUD 混悬液由阿斯利康制药有限公司提供； 糖皮质激素受体（GR）免疫组化检测试剂盒购自 武汉博士德生物工程有限公司；NF-κB（P-65）免 疫组化检测试剂盒及小鼠二步法检测试剂盒购自 北京中杉金桥生物技术有限公司；卵清蛋白（OVA） 购自上海博舜生物科技有限公司；压缩雾化机购 自德国百瑞公司。 1.2　实验动物及分组

健康 6~8 周龄的雄性 BALB/c 小鼠共 24 只， 体重 23±3 g，由中南大学实验动物学部提供，符 合二级动物标准，饲养于中南大学实验动物学部。 按照完全随机方法将小鼠分为生理盐水对照组（对 照组）、哮喘模型组（哮喘组）和 BUD 治疗组（BUD 组），每组 8 只。 1.3　小鼠哮喘模型的建立

参照 Mayuzumi 等^[2] 的方法制备小鼠哮喘模 型。哮喘组小鼠分别于第 1、14 天腹腔注射 OVA 混悬液（100 μg OVA+10 mg 氢氧化铝 +0.2 mL 生 理盐水）0.2 mL 致敏，并于第 14 天以 2% OVA 溶 液5 mL 雾化吸入激发1 次，第25 天起予以1% OVA 溶液 5 mL 雾化吸入激发，每日 1 次，每次 30 min，连续激发 10 d，小鼠出现呼吸急促、烦躁 不安、腹肌痉挛、两便失禁为阳性反应。BUD 组 致敏及激发步骤同哮喘组，并从第 25 天起于每次 激发前 30 min 雾化吸入 BUD 雾化液 5 mL（含 BUD 1 mg），每日 1 次，连续 10 d；对照组腹腔注射致 敏以及雾化吸入激发均以等量生理盐水替代。 1.4　嗜酸性粒细胞计数

于末次雾化24 h 后处死小鼠，开胸，结扎左肺， 以 1 mL 生理盐水灌洗右肺并回收灌洗液，重复灌 洗 2 次，收集的灌洗液以 2 000 r/min 离心 10 min， 收集上清液储存于 -20℃；细胞用 0.8 mL 嗜酸性 粒细胞（EOS）稀释液（2% 伊红溶液 5 mL+ 丙酮 5 mL+ 双蒸水 90 mL）重悬，取 0.1 μL 重悬液对细 胞计数板进行充池，然后在光镜下行 EOS 计数。 1.5　小鼠肺组织病理标本的制备

灌洗完毕后，分离小鼠结扎的左肺，浸入 4% 多聚甲醛固定 24 h，梯度酒精脱水、透明、浸蜡、 石蜡包埋，行小鼠肺组织切片，厚度约 3 μm，常 规苏木精 - 伊红染色，光镜下观察病理改变。 1.6　免疫组化检测小鼠肺组织 GR 和 NF-κB 水平

将已固定的肺组织常规脱水、浸蜡、包埋后 切片，厚度约 5~8 μm；载玻片采用多聚赖氨酸防 脱片处理；捞片后置烤箱中，58℃约 1 h，使切片 紧密黏附于玻片上；切片常规脱蜡；3％ H2O2去 离子水孵育 10 min，以消除内源性过氧化物酶活 性；蒸馏水洗，PBS 浸泡 5 min；微波抗原修复； 4% 山羊血清封闭，37℃温箱孵育 30 min；甩掉多 余液体，不洗；滴加一抗工作液，37℃孵育 2 h，4℃ 过夜；PBS 洗 4 遍；滴加生物素标记的二抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3 遍；滴加链霉素抗生物素蛋白 -过氧化物酶溶液，37℃温箱孵育 30 min，PBS 洗涤； DAB 显色，苏木素复染；封片，普通光镜下观察。 每只动物随机取 3 张切片，每张切片随机取 5 个 高倍镜视野，计数每个视野阳性细胞数，算出平 均数即为每张切片阳性细胞的百分比。 1.7　统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分 析。计量资料用均数 ± 标准差（x±s）表示，多 组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采 用 SNK-q检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　临床症状

哮喘组小鼠激发后均出现不同程度的呼吸急 促、烦躁不安等症状，对照组及 BUD 组小鼠未见 明显异常表现。 2.2　各组小鼠 EOS 计数比较

哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF） 中 EOS 的 数 量（19.1±2.0×106/L）与对照组 （2.0±1.4×106/L）相比明显增加（P<0.05）； BUD 治疗后，BALF 中 EOS 数量（10.6±1.6×10 6/L） 与哮喘组比较明显减少（P<0.05），但仍高于对照 组（P<0.05）。 2.3　各组小鼠肺组织病理改变情况

对照组小鼠气道黏膜未见明显水肿，支气管 管腔光滑，气道及周围血管组织无明显炎性细胞 浸润，肺泡腔内未见炎性分泌物。哮喘组小鼠气 道黏膜可见水肿明显，黏膜上皮细胞肿胀，气道 管腔缩小，甚至完全闭塞，气道腔内可见炎性分 泌物，气道周围血管扩张充血，气道黏膜层、黏 膜下层以及血管周围组织可见大量的炎症细胞浸 润，以 EOS、单核细胞及淋巴细胞为主，另外可 见气道平滑肌增厚。BUD 组小鼠气道仍可见炎症 变化，但与哮喘组相比明显减轻。见图 1。

图 1　各组小鼠肺组织病理改变（苏木精 - 伊红染色，×100） 对照组小鼠肺组织未见明显炎症细胞浸润，支气 管管腔光滑，肺泡腔内无明显炎性分泌物；哮喘组小鼠气道周围血管扩张充血，支气管、肺泡等组织可见大量的炎症细胞浸润， 气道平滑肌增厚；BUD 组小鼠肺组织仍可见少量炎性细胞浸润以及血管充血，但较哮喘组明显好转。

哮喘组小鼠气道壁细胞中 GR 阳性细胞百分 比较对照组明显减少（P<0.05）；BUD 组小鼠气 道壁细胞中 GR 阳性细胞百分比较哮喘组明显升 高，但仍低于对照组（P<0.05）；相反，哮喘组 小鼠气道壁细胞中 NF-κB 阳性细胞所占百分比较 对照组明显增多，而 BUD 组小鼠气道壁细胞中 NF-κB 阳性细胞所占百分比与哮喘组比较明显减 少，但仍高于对照组（P<0.05）。见表 1，图 2。

表 1(Table 1)

表 1　各组小鼠肺组织 GR 和 NF-κB 水平比较　（x±s，%）

表 1 各组小鼠肺组织 GR 和 NF-κB 水平比较　（x±s，%）

图 2　小鼠肺组织免疫组化结果（DAB 显色，×100） 哮喘组小鼠气道壁细胞中 GR 阳性细胞较对照组明显减少； BUD 组小鼠气道壁细胞中 GR 阳性细胞较哮喘组明显升高，但仍低于对照组；相反，哮喘组小鼠气道壁细胞中 NF-κB 阳性细 胞较对照组明显增多，而 BUD 组小鼠气道壁细胞中 NF-κB 阳性细胞较哮喘组明显减少，但仍高于对照组。图中棕色颗粒为阳 性细胞。

哮喘是一种以 EOS 浸润为特征的气道炎症性 疾病 ,伴有多种炎症介质和细胞因子参与。由于哮 喘发病机制复杂，哮喘动物模型在研究中发挥了 重要的作用。本研究采用 OVA 混悬液雾化吸入激 发 BALB/c 小鼠建立哮喘模型，结果显示小鼠激发 后均出现不同程度的呼吸急促、烦躁不安等症状， 病理观察显示哮喘组小鼠气道黏膜明显水肿，气 道管腔缩小，甚至闭塞，气道腔内可见炎性分泌物， 气道黏膜层、黏膜下层以及血管周围组织可见大 量 EOS、单核细胞及淋巴细胞浸润，气道平滑肌 增厚，BALF 中 EOS 数量增多，提示小鼠哮喘模型 制备成功。

GC 是目前应用最为广泛的甾体类抗炎药物， 其在哮喘治疗中的作用已成为国际共识^[3]。本研究 结果显示与哮喘组比较，BUD 吸入治疗后，小鼠 肺部炎性细胞浸润明显减轻，BALF 中 EOS 数量明 显减少，但与对照组比较 BALF 中 EOS 仍有明显 增高，提示 BUD 吸入治疗有明显的疗效，但单一 使用吸入糖皮质激素不能完全控制气道炎症。

NF-κB 是重要的促炎细胞因子的转录调节 器，NF-κB 活化在哮喘的发病过程中发挥重要的 作用。多种与哮喘发生有关的细胞因子和酶类， 如 IL-1β、IL-4、巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、 TNF-α、巨噬细胞炎性蛋白质-1α（MIP-1α）、环 氧合酶（COX-2）、细胞黏附分子-1（ICAM-1）等， 其基因都受到 NF-κB 的调节 [4-5]。

有证据表明，GC 能够促进抑制蛋白 IκB-α表 达的上调，阻断 NF-κB 的活化，抑制 NF-κB 依赖 的基因转录^[1]，达到减轻气道炎症、控制哮喘的目 的。而 GC 需要通过与 GR 结合才能发挥抗炎作用。 已证实在气道中 GR 主要存在于上皮细胞和支气管 平滑肌内，未激活的 GR 以蛋白复合物的形式存在， GC 与 GR 结合后，受体 / 激素复合物移行至胞核， 形成同型二聚体，与相对应的顺式作用 DNA 序 列即糖皮质激素应答元件（glucocorticoid-response elements,GREs）相结合，进而阻断或者刺激靶基 因的转录^[6] 。NF-κB 与 GR 结合形成复合物调节多 种基因的转录，包括 GR 本身的基因转录^[7]。研究 发现，COPD 患者的外周血白细胞中，GR 水平明 显低于正常对照组，在重症哮喘患者的外周血单 核细胞中，GR 的亲和力也是下降的，经过治疗后， 哮喘患者外周血白细胞中的 GR 水平上调^[8]。

有研究表明，GR 和 NF-κB 可能在功能上互为 转录拮抗因子，机制可能为：（1）NF-κB和GR 之间的直接物理联系，NF-κB p65 的 RHD 结构域 和 GR 的 DBD 结构域参与两者间的直接作用，互 相抑制其转录活化功能；（2）NF-κB与GR竞争 有限的转录辅助因子，如 CREB 结合蛋白（CBP）， CBP 在两者的转录活化过程中都是必需的，而数 量有限，二者通过竞争抑制对方的活性；（3）GC 可直接结合 I κB-α基因启动子上的 GC 结合位点， 活化 I κB-α基因的启动子，促使 I κB-α表达的上 调，进而抑制 NF-κB 依赖的基因转录 ^[9]。本研究 免疫组化结果显示与对照组相比，哮喘小鼠气道 壁细胞中 GR 的表达减少，而 NF-κB 的表达增加； 经 BUD 雾化治疗后，与哮喘组相比，BUD 组小鼠 气道壁细胞中 GR 表达增加，NF-κB 的表达减少； 说明 BUD 雾化治疗哮喘的机制可能与上调 GR 水 平和抑制 NF-κB 的活性有关，通过抑制 NF-κB活 化，阻断炎症因子的作用，抑制气道的炎症反应， 使哮喘患者的病情得到缓解。