手足口病（hand foot and mouth disease,HFMD） 是一种主要由肠道病毒71 型（enterovirus 71, EV71）和柯萨奇病毒A16 型（coxsackievirus A16, CA16）感染引起的好发于婴幼儿的传染病^[1]。重 症病例可累及中枢神经系统、呼吸系统和循环系 统，出现脑干脑炎等并发症^{[2, 3]}，导致病人死亡。 本课题组既往研究表明，重症EV71 严重感染病例 存在着炎症反应综合征的临床表现^[4]。有研究报 道，EV71 感染单核细胞可致Toll 样受体（toll like receptor,TLR）2、7、8 表达上调^[5]，但尚无体内 试验的报道。为探索TLR7、8 是否参与EV71 感 染病人的炎症反应综合征，本研究对EV71 重症感 染死亡病例脑和肺组织切片中TLR7、8 的表达状 况进行了研究。

选取2010 年3 月至2012 年11 月来自桂林市 各县市级医院因EV71 感染死亡并于本院病理科尸 检的9 例患儿为研究对象。所有死亡病例都具有 手足口病的临床表现，同时均经RT-PCR 法在肛 拭子中检测到EV71 病毒核酸，符合卫生部《肠道 病毒EV71 感染诊疗指南（2008 年版）》确诊标 准^[6]。对照组为同期我院非感染死亡儿童病例7 例， 其中外伤后失血性休克死亡儿童4 例，先天性心 脏病死亡儿童3 例（猝死2 例，术后死亡1 例）， 均未合并感染性疾病。本课题经桂林医学院附属 医院伦理委员会审核批准，所有死亡患儿家属均 已签署尸检知情同意书。

兔抗人TLR7 单克隆抗体和兔抗人TLR8 单克 隆抗体（北京博奥森公司），羊抗鼠/ 兔快速免疫 组化MaxVision TM 检测试剂盒及DAB 显色试剂盒 （福州迈新生物技术开发公司）。

尸检取肺、脑组织，中性甲醛固定，石蜡包 埋，3 μm 切片常规脱蜡。每例标本取3 张切片， 每连续切5 片取一张。免疫组化SP 法染色步骤严 格按照抗体说明书所附的免疫组化操作流程进行。 用已知的阳性组织做阳性对照，用PBS 代替一抗 作阴性对照。

Olympus 正置荧光显微镜下随机选取5 个不重 叠的高倍镜（×400）视野，免疫组化阳性结果（细 胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒）的判定标准为： （1）阳性细胞的百分比：<1% 计0 分；1%~10% 计1 分；10%~30% 计2 分；31%~60% 计3 分； >60% 计4 分。（2）阳性细胞的染色强弱得分： 基本不着色计0 分；淡黄色计1 分；黄色或棕褐 色计2 分；深棕色计3 分。（1）+（2）即为标本 的免疫组化阳性表达水平评分：0~1 分为阴性（-）， 2~3 分为弱阳性（+），4~5 分为阳性（2+），6~7 分为强阳性（3+）。所有切片均由课题组内的一 位病理科副主任医师和一位硕士研究生在不了解 患者临床资料的情况下独立观察判断，对独立判 断不一致的病例再共同进行观察。

每张切片随机选取5 个高倍镜视野拍照， 采用Image Pro Plus version 6.0（IPP）图像分析软 件，测定阳性信号积分光密度值（integrated optical density,IOD），对免疫组化结果进行半定量分析。

采用SPSS 18.0 统计软件包对实验数据进行统 计学分析。非正态分布计量资料采用中位数（四 分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）] 表示，两个独立样本 的比较采用Mann-Whitney U 检验；EV71 组内不同 因子在相同组织中的表达比较采用配对样本比较 的Wilcoxon 符号秩检验，P<0.05 为差异有统计学 意义。

TLR7 在EV71 组和对照组肺、脑组织中均有 阳性表达。肺组织中TLR7 的阳性表达位于单核- 巨噬细胞、淋巴细胞胞浆，部分中性粒细胞也有 阳性表达，部分支气管壁上皮细胞、少数肺泡上 皮细胞亦显阳性。TLR7 在EV71 组肺组织中呈强 阳性表达，在对照组肺组织中呈弱阳性到阳性表 达。脑组织中TLR7 的阳性表达主要在神经细胞、 小胶质细胞以及部分淋巴细胞的胞浆。TLR7 在 EV71 组脑组织中呈强阳性表达，在对照组脑组织 中呈弱阳性表达（图 1）。EV71 组及对照组肺及脑组织TLR7 IOD 值见表 1，EV71 组TLR7 在肺和 脑组织中均呈强阳性高表达状态，与对照组比较 差异有统计学意义（P=0.001）。

图 1 TLR7 在肺和脑组织中的表达（IHC，×400）　A： 对照组肺组织；B：EV71 组肺组织；C： 对照组脑组织； D：EV71 组脑组织。TLR7 在EV71 组肺、脑组织中呈强阳性表 达，而在对照组肺、脑组织中呈弱阳性至阳性表达。棕黄色颗粒 系TLR7 阳性表达细胞。

表 1(Table 1)

表 1 TLR7 在肺和脑组织中的表达IOD 值 [P50（P25, P75）]

表 1 TLR7 在肺和脑组织中的表达IOD 值 [P50（P25, P75）]

TLR8 在EV71 组和对照组肺、脑组织中均有 阳性表达。肺组织中TLR8 的阳性表达主要位于 炎症细胞的胞浆部分，呈棕色到棕褐色不等，少 许支气管壁肺泡上皮细胞也显阳性着色。TLR8 在 EV71 组肺组织中呈强阳性表达，在对照组肺组织 中呈弱阳性到阳性表达。脑组织中TLR8 的阳性 表达主要表现在神经细胞、胶质细胞以及部分淋 巴细胞的胞浆，呈棕黄色到棕褐色不等。TLR8 在 EV71 组脑组织中呈强阳性表达，在对照组脑组织 中呈弱阳性到阳性表达（图 2）。EV71 组及对照 组肺及脑组织TLR8 IOD 值见表 2，EV71 组TLR8 在肺和脑组织中均呈强阳性高表达状态，与对照 组比较差异有统计学意义（P=0.001）。

图 2 TLR8 在肺和脑组织中的表达（IHC，×400）　　A：对照组肺组织；B：EV71 组肺组织；C：对照组脑组织；D： EV71 组脑组织。TLR8 在EV71 组肺、脑组织中呈强阳性表达， 而在对照组肺、脑组织中呈弱阳性至阳性表达。棕黄色颗粒系 TLR8 阳性表达细胞。

表 2(Table 2)

表 2 TLR8 在肺和脑组织中的表达IOD 值 [P50（P25, P75）]

表 2 TLR8 在肺和脑组织中的表达IOD 值 [P50（P25, P75）]

TLR7、8 在EV71 组的肺组织中均呈强阳性 表达，二者的IOD 值差异无统计学意义（P=0.066）。 TLR7、8 高表达于EV71 感染后的脑组织中，二者 的IOD 值差异亦无统计学意义（P=0.110）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 　TLR7、8 在EV71 组肺和脑组织中的表达比较 [P50（P25, P75）]

表 3 　TLR7、8 在EV71 组肺和脑组织中的表达比较 [P50（P25, P75）]

EV71 是导致手足口病最主要的病毒， 2008~2009 年国家传染病信息管理数据显示轻症 手足口病EV71 阳性率为52.6%，重症者阳性率为83.5%，死亡患者阳性率为96.1%^[7]。EV71 属于单 股正链小RNA 病毒，是小核糖核酸病毒科肠道病 毒属的成员。危重型手足口病的临床特征符合全 身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）的4 个诊断指标，EV71 脑干脑炎 合并肺水肿患儿的全身炎症反应往往伴随着异常 大量的IL10、IL13、INF-α 和IFN-γ 产生^{[8, 9, 10, 11]}。越 来越多的研究表明重症EV71 感染合并肺水肿患 儿，既有促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ 释 放增加，也有抗炎因子IL-10、IL-13 分泌亢进及 CD3+、CD4+T 淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）等 细胞免疫的抑制^{[12, 13, 14]}。TLRs 是一类重要的模式识 别受体，在人类有10 种，即TLR1~10^[15]。在TLRs 家族中识别病毒的主要有TLR2、TLR3、TLR4、 TLR7/8、TLR9 等。TLR7/8 主要识别ssRNA 病毒， TLR3 识别dsRNA 病毒，TLR9 识别病毒的染色体 基因CPG DNA 序列，TLR2 和TLR4 也涉及病毒包 膜糖蛋白的识别^{[16, 17, 18]}。已知鼻病毒、埃可病毒、 轮状病毒、柯萨奇病毒、禽流感病毒在不同的细 胞通过上调TLRs 表达诱导促炎因子产生，启动抗 病毒免疫或炎症反应^{[19, 20, 21, 22]}。在EV71 感染中，TLRs 同样也能启动抗病毒免疫。Gong 等^[5] 研究发现， 分别用活的EV71 病毒体外感染、紫外线灭活的 EV71 处理巨噬细胞，均可以使得TLR2、TLR7 和 TLR8 mRNA 的表达上调，还可以诱导巨噬细胞释 放前炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α。认 为EV71 感染时，巨噬细胞通过TLRs 激活，诱导 产生大量促炎因子，参与EV71 感染炎症反应的病 理过程。

本研究发现TLR7、8 在EV71 感染后的肺组 织中的阳性表达均显著高于正常对照组中的肺组 织。TLR7、8 在EV71 组脑组织中的阳性表达均明 显高于对照组脑组织，推测TLR7、8 在EV71 感 染后的中枢神经系统及肺部病变中具有促进作用， 可能与EV71 感染所致手足口病的发病机制关系密 切，但其具体机制如何，仍需进一步探讨其下游 信号传导分子。

因本课题研究资源仅限尸体解剖肺、脑组织 蜡块，实验方法及所测因子尚不够全面，故研究 存在一定的局限性，我们下一步将从Toll 样受体 介导的炎症信号通路的角度，体外单核细胞株模 拟感染、患者血原代单核细胞分离培养及干预等多层次多方面进行研究。争取为EV71 感染所致手 足口病的临床诊治工作提供更多的理论及实验室 依据，为获得更多更有效的治疗措施开拓新的方 向。