过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura,HSP）是儿童最常见的一种自身免疫性血管炎性疾病，好发于学龄儿童，可累及皮肤、胃肠道、关节、肾脏等多个系统^[1]。研究表明，免疫功能紊乱是HSP发病的主要因素^[2]。其中滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfh细胞）是新近发现的效应性CD4⁺T细胞亚群，主要辅助B细胞的分化并促进抗体类别转换^[3]；滤泡调节性T细（follicular regulatory T cells,Tfr 细胞）是源于Foxp3⁺调节性T细胞（Treg 细胞）的细胞，主要参与负性调控Tfh细胞及抑制生发中心B细胞分化^[4]。Tfh细胞及Tfr细胞的异常表达参与了多种自身免疫性疾病的发病过程^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}，但其在儿童HSP发病中的作用尚未明确。本研究通过检测HSP患儿外周血Tfh细胞、Tfr细胞及相关调控因子表达的变化，旨在探讨其在HSP发病中的作用及可能机制。

研究对象为我院2013年1月至2014年10月收治的新发HSP患儿40例，均符合中华医学会儿科学分会免疫学组制定的HSP诊断标准^[11]，其中男24例，女16例，年龄6~14岁，中位年龄9.6岁，所有患儿均未接受肾上腺皮质激素及免疫抑制剂的治疗。对照组25例，其中男14例，女11例，年龄6~14岁，中位年龄9.8岁，为我院同期体检的健康儿童，既往无肾脏疾病、变态反应性疾病史，近期无明确感染征象。两组受试儿童性别、年龄的差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究获得我院学术伦理委员批准，所有受试对象的法定监护人均签署知情同意书。

HSP患儿于治疗前留取外周静脉血4 mL，对照组儿童随机留取外周静脉血4 mL，EDTA抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。取两管分离好的PBMC悬液，分别加入10 μL的CD4-FITC、CXCR5-APC和ICOS-PECy5单克隆抗体（美国eBioscience公司产品），避光孵育30 min，加入500 μL的红细胞裂解液，其中1管PBMC悬液于PBS洗涤后进行流式细胞仪检测；另1管于PBS洗涤离心后加入Foxp3-PE（美国eBioscience公司产品），避光孵育15 min，PBS洗涤后进行流式细胞仪检测，分析Tfh（CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺）细胞和Tfr（CD4⁺Foxp3⁺CXCR5⁺ICOS⁺）细胞的表达。

采用RT-PCR法进行检测。根据GenBank靶基因序列设计引物，以GAPDH为内参，具体见表 1，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用免疫磁珠法分离PBMC中的CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25⁺Treg细胞，提取细胞总RNA，并反转成cDNA第一链，取l μL cDNA进行PCR扩增30~40个循环，取5 μL 的B细胞淋巴瘤-6（B cell lymphoma 6,Bcl-6）、c-MAF、B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1（B lymphocyte induced maturation protein 1,Blimp-1）、程序性死亡分子-1（programmed death-1,PD-1）及GAPDH扩增产物，2%琼脂凝胶电泳30 min，回收纯化后送检测序，结果与GenBank中靶基因mRNA序列一致。然后采用SYBR-Green试剂盒，罗氏480实时荧光定量PCR仪分别检测CD4⁺T细胞Bcl-6、c-MAF、Blimp-1、PD-1 mRNA以及CD4⁺CD25⁺Treg 细胞Blimp-1、PD-1 mRNA表达，采用Relative Quantification模式进行数据分析。

表 1(Table 1)

表 1 RT-PCR引物序列表

表 1 RT-PCR引物序列表

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间均数的比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

HSP患儿外周血Tfh细胞比例较对照组显著升高（P＜0.05），Tfr细胞比例较对照组显著下降（P＜0.05），Tfh/Tfr比值显著升高（P＜0.05），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 HSP组和对照组外周血Tfh和Tfr细胞比例及其比值的比较　(x±s)

表 2 HSP组和对照组外周血Tfh和Tfr细胞比例及其比值的比较　(x±s)

与对照组相比，外周血CD4⁺T细胞Bcl-6、c-MAF mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）；Blimp-1 mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）；CD4⁺CD25⁺Treg 的PD-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），Blimp-1 mRNA表达水平显著下降（P＜0.05），见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 HSP组和对照组外周血Bcl-6、c-MAF、Blimp-1、PD-1 mRNA表达的比较　(x±s)

表 3 HSP组和对照组外周血Bcl-6、c-MAF、Blimp-1、PD-1 mRNA表达的比较　(x±s)

HSP是由免疫复合物介导的系统性血管炎症疾病，其发病涉及体液免疫紊乱、T细胞亚群功能失调及细胞因子异常分泌等多种免疫失调，具体机制仍尚未完全明确。目前认为HSP患儿体内自身反应性B细胞过度活化导致IgA抗体过度产生是其发病的核心机制^[12]，但导致自身反应性B细胞过度活化的机制至今尚未阐明。

近年来学者们发现了的一种新的CD4⁺T细胞亚群，定位于淋巴滤泡，其表型为CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺，可辅助B细胞增殖、分化、产生免疫球蛋白并参与抗体类别转换，称之为Tfh细胞。Tfr细胞源于Foxp3⁺ Treg，免疫表型为CD4⁺Foxp3⁺CXCR5⁺ICOS⁺，主要参与负性调控Tfh细胞诱导生发中心B细胞的促生发中心反应，减少或抑制自身抗的生成。既往研究发现，多种自身免疫性疾病如免疫性血小板减少症、系统性红斑狼疮、Graves病、支气管哮喘、银屑病、强制性脊柱炎、干燥综合征等存在着Tfh和Tfr细胞的异常表达。新近研究发现，HSP患儿外周血中Tfh细胞比例升高^[13]，可能是导致HSP免疫功能紊乱的主要原因，但迄今尚无有关Tfr细胞在HSP发病中的作用研究。本研究发现，HSP患儿外周血Tfh细胞比例显著升高，与既往研究报道一致^[13]。同时本研究亦发现，HSP患儿外周血Tfr细胞比例显著下降，Tfh/Tfr比值显著升高，提示Tfh及Tfr细胞异常表达可能参与了儿童HSP的发病过程。

本研究亦探讨了Tfh及Tfr细胞异常表达的可能机制，即检测了其相关调控因子Bcl-6、c-MAF、Blimp-1、PD-1 mRNA表达的变化。其中Bcl-6是决定Tfh细胞分化的转录调控因子，表达于生发中心B细胞和CD4⁺T细胞中，并介导调控二者的分化，其表达缺失可影响生发中心的形成以及B细胞对T细胞依赖抗原的应答；c-MAF具有诱导IL-21表达的能力，同时也可诱导CXCR5的表达，Bcl-6和c-MAF的共同表达可共同诱导CXCR4、PD-1及ICOS，进而促进Tfh发育和功能分化^{[14, 15]}。Blimp-1作为Bcl-6的拮抗因子，是抑制Tfh的分化与发育的主要因素，Blimp-1能直接抑制B细胞和T细胞Bcl-6的表达，其活性也可被Bcl-6抑制；同时Blimp-1亦可促进Tfr细胞的免疫抑制功能^[16]。PD-1是抑制Tfh的分化与发育的主要转录因子，同时PD-1的过度表达可抑制Tfr细胞的产生^[17]。本研究结果提示HSP患儿外周血CD4⁺T细胞Bcl-6、c-MAF mRNA表达水平较对照组儿童显著升高，Blimp-1 mRNA表达水平较对照组儿童显著下降；CD4⁺CD25⁺Treg细胞的PD-1 mRNA表达水平较对照组显著升高，Blimp-1 mRNA表达水平较对照组儿童显著下降。推测上述因子的异常表达可能是导致Tfh细胞过表达及Tfr细胞抑制表达的重要原因。

总之，本研究显示Tfh细胞、Tfr细胞及其相关调控因子的异常表达参与了儿童HSP的发病过程，对其检测有助于进一步完善HSP的免疫学发病机制，并为该类疾病的治疗拓展新的思路，同时亦为其他自身免疫性疾病的机制探讨提供了方向。