苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase,PAH）基因突变导致苯丙氨酸羟化酶活性降低或丧失，苯丙氨酸（phenylatanine,Phe）在体内异常蓄积，引起严重智力低下及神经行为异常的一种常染色体隐性遗传病^[1]。PKU 的分子基础是PAH 基因的异常突变，这类突变包括所有外显子以及内含子、5'-UTR 和3'-UTR 等区域。突变形式也涵盖错义突变、小缺失、剪切位点突变、沉默突变、无义突变、小插入及大片段插入等^[2]。迄今为止，世界范围内报道的PAH 基因突变已达859 种，这为全面阐述PKU 发病的分子机制奠定了基础。青海地区作为古今“丝绸之路”上的重要区域，伴随几千年来的经贸往来、文化交流和民族间通婚，也造就本地区不同民族间遗传基因的彼此交叉和融合，对青海地区的遗传流行病学和人类迁徙学产生了广泛的影响。对青海地区PKU 患者进行PAH 基因的突变谱研究，对于指导本地区产前诊断、携带者筛查及了解PAH 基因的进化、漂移非常重要。现对青海地区确诊的49 例PKU 患儿及其父母进行PAH 基因突变分析，以探究青海地区PAH 基因的突变规律及特点，现报告如下。

选取2006 年1 月至2012 年12 月在青海省妇幼保健院经新生儿疾病筛查（该院承担全省新生儿筛查工作）及门诊遗传咨询发现并确诊的49 例PKU 患儿为研究对象，其中男26 例，女23 例；汉族32 例，回族13 例，藏族3 例，土族1 例，年龄范围从2 个月至11 岁，平均年龄2.6±0.7 岁。初诊血清Phe 浓度在273~2540 μmol/L 之间（ 正常参考值 ＜120 μmol/L）。确诊标准： 对Phe 浓度>120 μmol/L 患儿进行复查，复查Phe 浓度仍然>120 μmol/L 且血Phe 与酪氨酸比值>2.0，首先确诊为高苯丙氨酸血症，再采集患儿血样及尿液标本进行血二氢蝶呤还原酶测定、四氢生物蝶呤（BH4） 负荷试验（>600 μmol/L） 或者Phe 和BH4 联合负荷试验（≤ 600 μmol/L）及尿蝶呤谱分析，排除四氢生物蝶呤缺乏症、一过性高Phe 血症和酪氨酸血症等。对Phe>600 μmol/L 患儿行低Phe 饮食控制治疗。所有受试患儿家长均签署知情同意书。

抽取患儿及父母外周静脉血1 mL，滴于滤纸上呈3~5 个滤纸斑，阴凉干燥避光处晾干，1~2 h后装入无菌干净密封袋内备用。采用血片快速酚/ 氯仿抽提法，将带有血样的卡片沿血滴四周剪下，用1×TE（Tris-EDTA 缓冲液）500 μL 和250 mmol/L NaCl 800 μL 洗涤1 次，然后加入200 μL 消化缓冲液（pH 值为8.0 的100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、20 mmol/L 乙二胺四乙酸、150 mmol/L NaCl、2% 十二烷基硫酸钠）和5 μL 蛋白酶K，65℃水浴1 h。不去除血片直接在消化液中加200 μL 饱和酚- 氯仿- 已戊醇（25 : 24 : 1），以提取基因组DNA。

PAH 基因启动子及第1~13 外显子的引物序列参照文献^[3]，由上海生工设计合成（表 1）。在美国ABI 9700 型扩增仪上进行PCR 反应。PCR 总体积20 μL，包括DNA 模板2 μL，25 μmol/L 引物0.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，3 U/mL Taq DNA 聚合酶1 μL，4×PCR buffer 5 μL，dd H2O 7.5 μL。各成分混匀后先95℃预变性15 min；然后进入95℃变性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸60 s，循环11 次；再95℃变性45 s，57℃复性45 s，72℃延伸60 s，循环24 次；最后72℃ 7 min 后降温至4℃备用。PCR 产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测。采用PCR产物直接测序法，样品纯化及序列分析应用美国ABI 3130 XL 型序列分析仪完成。每个测序样品进行两次PCR，分别测定正、反方向的基因序列，所有序列变异位点均针对该位点，检测患者父母的DNA 序列，以确定序列变异来源。

表 1

表 1 PAH 基因启动子及各外显子引物序列

表 1 PAH 基因启动子及各外显子引物序列

已知突变的命名结合测序结果参照http://pahab.mcgill.ca 提供的突变名称命名。新序列变异通过查阅PAH 相关数据库（http://www.biobaseinternational.com/product/hgmd、http://pahab.mcgill.ca、http://www.biopku.org/pah 和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）来确定，所有新变异均通过100 名健康无关个体相应外显子测序排除为多态性位点后被认定为新突变。新突变的命名参照http://www.hgvs.org/mutnomen 提供的命名法来命名。

应用SPSS 10.0 统计软件对数据进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ² 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

49例患儿均检测到突变位点，其中30 例患儿（61%）检测出2 个突变等位基因，18 例只检测出1 个突变等位基因，还有1 例患儿检出3 个突变等位基因。在PAH 基因的13 个外显子中，患儿突变等位基因分布在第2~3、5~7、10~12 外显子和第4 和11 内含子中，但大部分突变及常见突变主要分布在第3、6、7、11 外显子和第4 内含子区域，第7 外显子检测到26 个突变等位基因（27%），第11 外显子及剪切区检测到14 个突变等位基因（14%），第5 外显子及剪切区检测到12 个突变等位基因（12%），第6 外显子检测到11 个突变等位基因（11%），第3 外显子检测到11 个突变等位基因（11%），第12 外显子检测到3 个突变等位基因（3%），第2 外显子检测到2 个突变等位基因（2%），第10 外显子仅检测到1 个突变等位基因（1%）；最常见的基因突变是p.R243Q（19%）、IVS4-1G>A（9%）、p.Y356X（7%）、p.EX6-96A>G（5%），较常见的突变为p.I65T（3%）、p.R111X（3%）、p.P281L（3%）和 p.Q232X（3%），这8 种突变占总突变的65%，16 种突变只检测到1 个等位基因，每种突变的发生率仅为1%。见表 2。

表 2

表 2 青海地区PKU 患者PAH 基因突变检测结果　（n=49）

表 2 青海地区PKU 患者PAH 基因突变检测结果　（n=49）

在98 个PAH 等位基因中共检出30 种致病基因突变，总检出率为82%（80/98），主要包括错义突变19 种（63%）、无义突变5 种（17%）、缺失突变3 种（10%）、剪接位点突变3 种（10%）（表 2）； 经检索国内外文献及PAH 相关国际数据库，证实检测出的p.N93fsX5（c.279-282delCATC）、p.G171E（c.512G>A）是国际上未见报道的新的PAH 基因突变，并已提交国际PAH 突变基因数据库（http://pahab.mcgill.ca），p.H64fsX9（c.190delC）突变为国内第2 次报道。基因测序图如图 1~3 所示。

图 1

图 1 PAH 基因外显子3 中p.N93fsX5(c.279-282delCATC) 杂合子缺失突变 箭头所示为基因具体突变位点。

图 2

图 2 PAH 基因外显子6 中p.G171E(c.512G>A) 杂合子错义突变 箭头所示为基因具体突变位点。

图 3

图 3 PAH 基因外显子3 中p.H64fsX9(c.190delC) 杂合子缺失突变 箭头所示为基因具体突变位点。

p.R243Q 是青海、陕西、新疆、山西、甘肃、天津、北京及中国北方地区PAH 基因最常见的突变类型，既不同于台湾地区PAH 基因突变检出率最高为p.R241C（32％），也不同于江苏地区PAH 基因检出率最高突变为p.EX6-96A>G（15%），亦不同于浙江PAH 基因检出率最高突变为IVS4-1G>A 和p.R111X（ 均为10%）；p.Y356X 和p.IVS4-1G>A 突变在青海的检出率均显著高于江苏，且p.IVS4-1G>A 突变在青海的检出率还高于新疆、天津、北京及中国北方地区（P＜0.05）；p.EX6-96A>G 突变的检出率显著低于江苏，p.R111X 突变检出率低于天津（P＜0.05），而p.R413P 突变的检出率显著低于天津及中国北方地区（P＜0.05），见表 3。

表 3

表 3 青海与国内其他省份PAH 基因常见突变频率的比较　（%）

表 3 青海与国内其他省份PAH 基因常见突变频率的比较　（%）

p.R243Q 突变在青海地区的检出率显著高于在日本的检出率（P＜0.05），p.I65T 突变在青海地区的检出率显著低于在欧洲的检出率（P＜0.05），青海地区最常见突变为p.R243Q（19%），不同于日本、欧洲PAH 基因最常见突变分别为p.R413P（31%）和p.R408W（55%）。见表 4。

表 4

表 4 青海与日本和欧洲PAH 基因常见突变频率的比较　（%）

表 4 青海与日本和欧洲PAH 基因常见突变频率的比较　（%）

PAH 基因包含13 个外显子，编码451 个氨基酸，而13 个外显子及部分内含子中任何碱基的突变都可能引发PKU，并且不同国家和地区及不同民族间PAH 基因的突变特点和规律都不尽相同，表现出突变的复杂多样性^{[16, 17, 18, 19, 20]}。研究发现青海PAH 突变基因检出率为82%，与天津宋力等^[8]（94%）、北京瞿宇晋等^[9]（95%）和河北卢超霞等^[21]（98%）相比，突变基因检出率较低，但显著高于内蒙古张军力等^[22]、山西高伟华等^[6] 所报道检出率（均为61%），分析认为一方面可能与所采用方法有关，如联合采用高分辨熔解曲线和多重连接依赖探针扩增技术，可显著提高PAH 突变基因的检出率，另一方面，我们推测青海地区某些突变可能存在于被检测区域之外，如内含子、5'非翻译区、3' 非翻译区等或者有某些其他的致病机制在发挥作用，比如与基因表达密切相关的顺式作用元件、反式作用因子以及PAH 基因启动子或增强子的序列改变等影响了PAH 基因表达的效率。

青海地区49 例PKU 患者共检测到30 种PAH致病基因突变，广泛分布在PAH 基因第2~3、5~7、10~12 外显子及其两侧内含子区域，而常见的突变和大部分新突变比较集中在第3、6、7、11外显子及第4 内含子区域，既区别于日本人集中在第6、7、12 外显子，也与欧洲人更多集中在第3、10 和12 外显子明显不同，这充分表明青海人PAH基因突变的高度异质性，提示PAH基因第3、5、6、7 和11 外显子及其两侧内含子区域是青海地区PKU 群体研究的重点区域。另外，研究还发现p.R243Q 是青海、陕西、新疆、山西、甘肃、天津、北京及中国北方大多数地区PAH 基因最常见的突变，既不同于浙江地区PAH 基因最常见突变为IVS4-1G>A 和p.R111X（ 均为10%），也有别于江苏和台湾地区PAH 基因最常见突变为p.EX6-96A>G（15%）和p.R241C（32％），证实了中国北方与南方地区的PKU 患者在PAH 突变基因分布上存在显著差异性。此外，青海地区最常见的基因突变是p.R243Q（19%），明显低于欧洲国家的最常见突变p.R408W（55%~73%），也低于日本的最常见突变p.R413P（31%）。青海地区IVS4-1G>A 突变检出率（9%）也明显高于江苏、新疆、天津、北京及中国北方地区，p.V399V、p.R241C突变基因频率分别在甘肃和台湾地区最高，这些都充分说明在不同地区和种族人群之间PAH 基因突变位点及其分布具有巨大差异，这对制订不同国家及地区的PKU 基因诊断方案及PAH 基因突变起源研究具有重要参考价值。

本研究还发现2 种PAH 基因新突变p.N93fsX5（c.279-282delCATC） 和p.G171E，经检索国际PAH 基因突变数据库（截至到2014 年10 月），确认为中国人群中存在的国际上首次发现的PAH基因新突变。苯丙氨酸羟化酶通常以具有催化活性的四聚体形式存在，四聚体是由两个二聚体组成。苯丙氨酸羟化酶的单体由N 端调节区（1-142aa）、催化区（143-410aa）及C 端的四聚体区（411-452aa）三部分组成^{[23, 24]}。PAH 基因突变对酶活性的影响依赖于突变的形式和位置。p.N93fsX5（c.279-282delCATC）突变位于苯丙氨酸羟化酶的调节区域，由于在279-282 核苷酸之间发生了胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶（CATC）4 个碱基的缺失，导致由此往后排列编码第5 位氨基酸的密码子变为终止密码子，也使得合成的肽链缩短，从而影响了苯丙氨酸羟化酶蛋白的活性。p.G171E 突变是因为PAH 基因cDNA 第512 位的鸟嘌呤（G）被腺嘌呤（A）取代后，使得171 位编码甘氨酸的密码子（GGG）变成了编码谷氨酸的密码子（GAG），改变了苯丙氨酸羟化酶的结构并影响了酶活性功能。p.H64fsX9 突变是由于PAH 基因cDNA 第190 位核苷酸发生了胞嘧啶（C）的缺失突变，造成由此往后排列编码第9 位氨基酸的密码子变为终止密码子，使合成的肽链缩短，从而严重影响苯丙氨酸羟化酶蛋白的活性而导致。山西高伟华等^[6] 在山西省59 例经典型PKU患者中发现p.H64>TfsX9 突变，经仔细核对，其与p.H64fsX9（c.190delC）应属于同一突变，因此，本研究发现的p.H64fsX9（c.190delC）应该为国内第2 次发现。

青海地区检出的PAH 突变基因的特点比较复杂多样，既包含我国北方地区常见的突变类型，也与我国南方部分省区PAH 突变基因的分布特征有所差异，同时与日本、欧洲等国家及地区的PAH 基因突变分布特点大不相同。本研究明确了青海地区PAH 基因的突变类型、频率及特点，为青海地区PKU 的研究提供了重要补充资料，对本地区有效降低PKU 发病率，减少PKU 患儿的发生，提高人口素质具有重要意义。