糖原累积病Ⅱ 型（glycogen storage diseasetype Ⅱ ,GSD Ⅱ ,MIM 232300）由荷兰病理学家Pompe 在1932 年首次报道，是一种少见的常染色体隐性遗传病，是由于酸性α- 葡萄糖苷酶（acid-α-D-glucosidase,GAA,MIM 606800）基因缺陷所致。GAA 是溶酶体中糖原降解所必需的酶，能够使低聚糖和糖原分解成葡萄糖。该酶缺乏或者缺陷时，糖原不能被分解，引起溶酶体的破坏，从而引起骨骼肌、心肌、肝脏等多种组织的损伤。临床可表现为肌肉无力、心肌肥大、心功能不全等症状，严重者可因呼吸循环衰竭而死亡^[1]。其临床确诊需要进行酶活性测定、肌肉活检或基因检测^[2]。

本研究中，我们对一对疑诊GSD Ⅱ的双胞胎姐妹的外周血GAA 活性进行了检测，采取聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和直接测序的方法，对此两个患儿及其父母进行了GAA 基因的检测。两个患儿均携带有G1942A 的致病突变和G2214A 的疑似致病突变。本研究结果显示干血片法（dried blood spots,DBS）检测GAA活性可以作为GSD Ⅱ的筛查方法，继之进行GAA基因测序可以明确GSD Ⅱ患儿的基因诊断。

病例1，女，10 个月，因口周发青1.5 个月，反复咳嗽、流涕17 d，加重3 d 于2008 年11 月28 日入院。患儿为第2 胎第2 产，为双胎之大，足月正常产，出生时状况良好，10 个月仍不能独坐，不能翻身，抬头困难。其姐姐在14 个月时因“肺炎、脑瘫、先天性心脏病” 死亡。入院体查：体温36.5℃，心率170 次/min，呼吸 70 次/min。一般状态差，眼睑轻度水肿，面色晦暗，鼻腔内见黄白色分泌物，口周发绀，舌体肥大。心音低钝，节律规整，未及杂音。双肺可闻及散在喘鸣音、痰鸣音及湿罗音。肝肋下3 cm，质韧。双下肢肌力三级，肌张力低，腱反射未引出。辅助检查：血常规示白细胞（WBC）14.1×109/L（参考值 3.5~9.5×109/L）、淋巴细胞比例（LYN）37%（参考值 20%~50%）、中性粒细胞比例（GR）57.3%（参考值 40%~75%）；血液生化示谷丙转氨酶（ALT）122 U/L（参考值 9~50 U/L）、谷草转氨酶（AST）82 U/L（ 参考值 15~40 U/L）、肌酸激酶（CK）204 U/L（参考值 25~400 U/L）；胸片示双肺纹理增多、紊乱，心影向两侧扩大（图 1）；心脏超声示室间隔及左心室后壁呈向心性肥厚，心功能下降（射血分数38%）；腹部超声示肝上界第5 肋间、肋下平脐，剑突下脐上1 cm。入院后临床初步诊断为支气管肺炎、心力衰竭，给予积极抗感染、强心、对症治疗。治疗24 h 后，患儿一般状态好转，心率降至124 次/min，呼吸40 次/min，排尿1 次，进乳2 次，面色红润，口周发绀缓解，心衰纠正。住院治疗1 周后，患儿肺部罗音减少，肝脏肋下未触及，心影无明显减小，补充临床诊断：糖原累积症Ⅱ型?，家属拒绝继续住院治疗，签字离院，出院随访。患儿12 个月时吞咽困难加重，14 个月时四肢不能动，15 个月时在家中死亡。

图 1

图 1 病例1 胸部正位片 示双肺纹理增多、紊乱，心影向两侧扩大。

病例2，女，10 个月，因咳嗽、流涕伴发热17 d 于2008 年11 月28 日入院。患儿为双胎之小，足月正常产，出生时状况良好，2 个月会抬头，3个月会翻身，但随后生长发育逐渐落后，10 个月不会坐，不会翻身，不能抬头。入院体查：体温36.8℃，心率100 次/min，呼吸26 次/min。舌肥大，可闻及散在干罗音及痰鸣音，以右肺为主。肝脏右肋下2 cm。双下肢肌力三级，肌张力低，腱反射未引出。辅助检查：血常规示WBC 9.5×109/L；血液生化示AST 134 U/L，ALT 91 U/L，CK 456 U/L；胸片示双肺纹理增强，以双下肺为主；心脏超声示双心室向心性肥厚，左心增大，心功能下降（射血分数44%）；心电图示PR 间期缩短，QRS 波电压增高。临床诊断支气管肺炎，给予抗感染、对症、支持治疗。治疗1 周后，患儿肺部罗音基本消失，疑诊糖原累积症Ⅱ型，经家属要求，准予出院。患儿12 个月时，吞咽困难加重，14 个月时四肢少动，17 个月时在家中死亡。

DBS 法收集患儿的外周血标本。GAA 活性测定参考文献^[3]。打孔器取直径3 mm 的血片，置于深孔板内，加入360 μL 超纯水，震板仪上震荡1 h，充分洗脱，取50 μL，加入10 μL 80 μmol/L的阿卡波糖（pH 3.8，用40 mmol/L 醋酸钠缓冲液配制）及40 μL 70 mmol/L 的4- 甲基伞型酮-α-D-吡喃葡萄糖苷液（4-MUG），37℃下作用20 h，加入200 μL EDTA 缓冲液（pH 11.3，0.15 mol/L）。于免疫荧光检测仪下扫描荧光强度，每组均设空白对照。

取两个患儿及其父母的静脉EDTA 抗凝血标本，酚- 氯仿法提取基因组DNA，PCR 扩增患儿及其父母GAA 基因的外显子2~20，所用引物见相关文献^[4]。PCR 体系构成如下：LA Taq0.5 μL、2×GC buffer I 8.0 μL、dNTP Mixture 2.0 μL（2.5 mmol/L）、正反向引物分别为2.0 μL 和10.5 μL、模板DNA（100 ng/μL）1 μL。PCR 循环反应条件：94 ℃ 预变性1 min；94 ℃ 变性30 s，58~62 ℃ 退火30 s；72 ℃ 延伸30~60 s，共30~35个循环；72℃延伸5~8 min。用2% 琼脂糖凝胶电泳分离PCR 产物，在紫外灯下切出特异性目的条带，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit进行PCR 产物的回收。纯化后的PCR 产物送北京诺赛基因公司用ABI3730XL 进行测序，SquencingAnalysis TM 软件分析测序结果。

两个患儿的GAA 活性检测结果每小时均 ＜0.63 nM/punch，正常人GAA 活性每小时>7.92 nM/punch，两个患儿的GAA 活性均明显低于正常。

经过对患儿及其父母GAA 基因的编码区进行测序，发现两个患儿均为复合杂合突变。两个患儿GAA 基因第14 外显子上的第1 942 位碱基存在颠换（G1942A）（图 2 左），因腺嘌呤（A）取代鸟嘌呤（G），导致GAA 蛋白第648 位甘氨酸（Gly）被丝氨酸（Ser）取代（G648S）；经检测，该突变来自患儿母亲的杂合突变，患儿父亲该位点无突变。在两个患儿第16 外显子上同时存在一单核苷酸杂合无义突变（G2214A）（图 2 右），因腺嘌呤（A）取代鸟嘌呤（G），导致GAA 蛋白第738 位的色氨酸（Trp）变成了终止密码（W738X）；此突变来源于患儿父亲，也为杂合突变，患儿母亲该位点无突变。

图 2

图 2 GAA 基因检测结果 左图：GAA 基因第14 外显子上G1942A 突变（箭头所示），导致GAA 蛋白第648 位甘氨酸（Gly）被丝氨酸（Ser）取代（G648S）；右图：GAA 基因第16 外显子上G2214A 突变（箭头所示），导致GAA 蛋白第738 位的色氨酸（Trp）变成了终止密码（W738X）。

GSD Ⅱ是由于先天性GAA 缺陷所导致的代谢性疾病，根据发病年龄、受累器官和疾病进展速度可分为婴儿型和晚发型^[2]，病情的严重程度取决于患儿体内残留的GAA 活性。婴儿型患者体内的GAA 活性严重或者完全丧失，典型者于新生儿期到生后3 个月内起病，四肢松软、运动发育迟缓、喂养及吞咽困难。体格检查可见巨舌、肌张力低下、心脏扩大、肝脏肿大，心脏超声显示心肌肥厚和心功能不全，病情进展迅速，多于1 岁内死于左心衰或者肺部感染后的心肺功能衰竭。晚发型患者起病晚,病程进展慢,部分可仅表现为进展缓慢的全身性疾病，无器官肿大^{[2, 5]}。本文所报道2 例患儿在10 个月大时症状明显，心脏增大，外周血GAA 活性明显降低，分别在15 个月、17 个月大时先后死亡，属于婴儿型。

皮肤成纤维细胞的GAA 酶活性测定至今仍被认为是GSD Ⅱ诊断的金标准^[2]，但此种方法需取皮肤活检的成纤维细胞进行培养，需要4~6 周，明显延迟了诊断。肌肉病理和免疫组化检查可直接快速地检测肌肉组织中GAA 活性和糖原含量，但取材部位对检测结果影响很大，且为有创性检测，不易为患者接受，同时麻醉具有较大的风险性^[6]。因此探索新的无创性快速诊断方法非常重要。GAA 在外周血白细胞中也有表达，DBS 留取血液标本，以糖元或4-MU 作为底物测定GAA 活性，具有无创、便于运输、敏感、准确、快速、高通量等优点，具有广泛应用前景^{[3, 7, 8]}。本研究采用上述方法，检测发现患儿的白细胞GAA 活性明显下降后，经过基因检测明确诊断，进一步证实了该方法的可行性和准确性^[9]。

GAA 基因位于17q25.2-q25.3，全长约28 kb，至今，已经发现了GAA 基因的近300 种致病突变（www.pompecenter.nl/），主要集中在基因的3 个临界区域：含有起始密码子的2 号外显子；含酶催化部位的10 号和11 号外显子以及与蛋白高度保守区域相对应的14 号外显子。GAA 基因突变存在明显的种族特异性，在中国台湾地区人群中14号外显子的C1935A 突变是最常见的类型^{[10, 11]}。本研究的两个患儿均为复合杂合突变，第1 个位于GAA 突变热点区，14 号外显子的G1942A，导致G648S，已经被证明具有致病性^[12]；另一个突变是G2214A，导致W738X。经过检索，W738X 是第2次被报道，Zeng 等^[13] 在1 例婴儿型GSD Ⅱ患儿基因上检测到E888X/W738X，该患儿生后2 个月即出现喂养困难和全身肌无力，4 个月发现心脏增大，6 个月时死于心肺功能衰竭，患儿白细胞GAA 活性仅为正常对照的17.3%。因W738X 可导致GAA蛋白翻译提前终止，推测应为严重突变。

美国食品药品监督管理局于2006 年4 月批准上市了第一个重组GAA 酶用于GSD Ⅱ的治疗，早期诊断及早期酶替代治疗有希望改善婴儿型GSDⅡ的预后^{[14, 15]}。我国台湾地区及部分欧美国家已经开展GSD Ⅱ的新生儿筛查^{[16, 17]}，而实践证明，应用新生儿筛查结合酶置换治疗，能够明显改善GSD Ⅱ的预后^[18]。本文使用的DBS 留取外周血检测GAA 活性，对阳性者进行基因检测证实了在我国进行新生儿GSD Ⅱ筛查的可行性。