气道重塑是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要原因，传统观点认为，气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell,ASMC）是一种被动的细胞，在炎症介质的刺激下发挥调控气道舒缩的功能。新近研究证据表明，ASMC 还能发生表型转化，具有增殖、迁移、合成和分泌活性介质的能力，参与哮喘气道炎症发生、发展的全过程，可加重气道重塑进程^{[1, 2, 3]}。

感觉神经肽P 物质（substance P,SP）是非肾上腺素能非胆碱能（NANC）神经系统重要的神经递质，通过相应的神经激肽-1 受体（neurokinin 1receptor,NK-1R）发挥作用^[4]。本课题组前期研究结果表明，SP 可促进哮喘大鼠ASMC 的迁移，另外哮喘气道重塑时气道NK-1R 的mRNA、蛋白也表达增加，因此推测哮喘气道重塑时感觉神经肽SP 的作用可能是通过与受体NK-1R 结合影响平滑肌迁移实现的^{[5, 6]}，但NK-1R 在体外ASMC 的表达及对ASMC 迁移的作用尚未见报道。

本研究拟通过原代培养Sprague-Dawley（SD）大鼠ASMC，并给予NK-1R 拮抗剂WIN62577 干预，探讨NK-1R 在哮喘气道重塑大鼠ASMC 迁移中的作用。

羟脯氨酸碱水解法试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所；DMEM/ FBS 培养基购自美国Hyclone 公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；Ⅳ型胶原酶、4,6- 乙酰基-2- 苯基吲哚（DAPI）、WIN62577 购自美国Sigma 公司；兔抗大鼠α-SMA抗体、NK-1R 抗体购自Santa Cruz 公司；PCR 引物由Invitrogen 英骏生物技术有限公司合成，TRIzol 总RNA 提取液购自上海生工生物工程有限公司，Real time quantitive PCR（SYBRRPremix ExTaqTM）试剂盒购自TaKaRa 大连宝生物工程有限公司。transwell 小室购自美国Corning 公司。

SPF 级雌性SD 大鼠，体重60~80 g，购于中国医科大学实验动物中心。随机分为：哮喘气道重塑组和正常对照组，每组8 只大鼠。参考文献^{[7, 8, 9, 10]}分别于第1 天、第8 天腹腔注射抗原致敏液1 mL（含卵蛋白100 mg、氢氧化铝100 mg、灭活的百日咳杆菌5×10⁹ 个）。对照组注射等体积生理盐水。从第15 天开始，将大鼠置于一自制密闭容器（20 cm×20 cm×20 cm） 中，以1% 卵蛋白超声雾化吸入，每次30 min，每周3 次，激发8 周后处死。正常对照组用生理盐水代替卵蛋白。

采用图像采集系统（MetaMorph/BX41，日本）采集图像，测定支气管基底膜周径（Pbm）、总管壁面积（Wat）及平滑肌面积（Wam），分别以Wat/ Pbm 及Wam/ Pbm 代表相应管壁层的厚度。

应用碱水解法按试剂盒说明书（购自南京建成生物工程研究所第一分所）测定羟脯氨酸含量。

常规消毒麻醉后，左心室取血处死大鼠。无菌分离大鼠气管，剥离外膜，去除内膜。将气管平滑肌剪下，将组织剪碎，加0.1% 胰酶于37℃水浴振荡10 min，1 000 rpm/min 离心5 min，去上清。再加0.1% IV 型胶原酶，37℃水浴振荡30 min，1 000 rpm/min 离心5 min，去上清。加入10% 胎牛血清（FBS）的DMEM 终止反应，轻轻吹打，100 目细胞筛过滤，接种至50 mL 培养瓶，37℃孵箱培养，利用成纤维细胞贴壁较快的特点纯化ASMC。待细胞铺满瓶底后按1 : 2 传代，收集第3代细胞用于实验。

取对数生长期的细胞，消化制备单细胞悬液，适当调整密度后接种于六孔板中的盖玻片上。37℃ CO₂ 孵箱内培养过夜，待细胞贴壁伸展后，取出用4% 多聚甲醛固定。3M H₂O₂ 室温下处理10 min，3 g/L Triton100 在37 ℃ 作用10 min，用3%羊血清室温下封闭15 min。加兔抗大鼠NK-1R 抗体（1 : 100），置湿盒内4℃过夜。加入FITC 标记的山羊抗兔IgG 于37℃作用30 min。加DAPI 5 μg/mL，室温5 min。50% 甘油封片。每步之间用PBS 洗片。实验中以PBS 代替一抗设立阴性对照。

用SYBR Green I 荧光染料嵌合法，分别制作目的基因（NK-1R）和管家基因（GAPDH）的标准曲线。利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。待测基因mRNA 的相对表达量=待测基因基因拷贝数/GAPDH 基因拷贝数。NK-1R引物序列：上游5'-ACCAACACCTCTGAGTCTAA-3'；下游5'-TGGTCACTGTCCTCATTCT-3'。GAPDH 引物序列：上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。引物由Invitrogen 英骏生物技术有限公司合成。

分别取哮喘气道重塑组及正常对照组第3~5代ASMC 生长至80% 融合时，0.25% 的胰酶消化细胞，计数，用10% FBS 的DMEM 调整细胞密度至1×10⁵/mL，transwell 上室加入各组细胞悬液100 μL，下室加入10% FBS 的DMEM 600 μL。其中哮喘气道重塑组按随机化分配原则分别分为下列5 个亚组：（1）空白组：不加任何干预剂；（2）WIN62577 10^-11 mol/L 组；（3）WIN6257710-10 mol/L 组；（4）WIN62577 10^-9 mol/L 组；（5）WIN62577 10^-8 mol/L 组。每小组5 个复孔。进行迁移实验前，上室细胞预先用不同浓度的WIN62577 预处理细胞30 min。将各组小室置37℃孵箱，24 h 后取出小室，小心取出滤膜，棉签轻轻擦去微孔膜朝上一面未穿膜的细胞。膜下面的ASMC4% 多聚甲醛固定20 min，苏木素染色10 min，二甲苯透明1 min，中性树胶封片，倒置显微镜（×400）下随机计数5 个视野的细胞数，取均值。重复3 次。

应用SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

支气管的病理图像分析及羟脯氨酸测定结果显示，哮喘气道重塑组Wat/Pbm、Wam/Pbm、羟脯氨酸含量均较对照组增加（P＜0.01），表明哮喘气道重塑模型制作成功。见表 1。

表 1

表 1 各组大鼠气道壁厚度、平滑肌厚度和羟脯氨酸含量 的比较 （x±s）

表 1 各组大鼠气道壁厚度、平滑肌厚度和羟脯氨酸含量 的比较 （x±s）

倒置相差显微镜下观察细胞形态，未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形，胞质密度高，不透明，培养1 d 后，大部分细胞已贴壁，开始伸展，培养3 d，贴壁细胞完全伸展，呈梭形或多边形，内有1~2 个细胞核，细胞核位于细胞中央，有一至数个足突，部分区域细胞束状排列，呈“峰谷”状态学特征。培养7~9 d，细胞铺满瓶底。培养细胞达铺满状态所需时间与细胞活力和细胞接种密度有关，细胞活力愈大，接种密度愈大，达到铺满状态所需时间愈短。见图 1。

图 1

图 1 ASMC 形态观察（×100） 培养3 d，倒置相差 显微镜下观察细胞形态，贴壁细胞完全伸展，呈梭形或多边形， 内有1~2 个细胞核，细胞核位于细胞中央，有一至数个足突，部 分区域细胞束状排列，呈“峰谷”状态学特征。

对平滑肌细胞特异的α-SMA 进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察并成相，在488 nm 波长激光下，标记α-SMA 的FITC 发绿光，主要均匀分布在胞质。DAPI 标记胞核，其在356 nm 波长激光下发出蓝色荧光。见图 2。

图 2

图 2 α-SMA 免疫荧光染色细胞鉴定ASMC（×400）标记α-SMA 的FITC 发绿光，主要均匀分布在细胞质；DAPI 标记的是细胞核，发蓝色光。

荧光显微镜下观察NK-1R 主要分布在细胞质和细胞膜。哮喘气道重塑组灰度值明显高于对照组（P＜0.01）。哮喘气道重塑组ASMC 中NK-1R的mRNA 相对表达量较正常对照组明显增高（P＜0.01）。见表 2，图 3。

表 2

表 2 两组大鼠 ASMC 中NK-1R 灰度值及mRNA 比较（x±s）

表 2 两组大鼠 ASMC 中NK-1R 灰度值及mRNA 比较（x±s）

图 3

图 3 ASMC 中NK-1R 的免疫荧光染色（×400） NK-1R 主要分布在细胞质和细胞膜，发绿色荧光；A：对照组，NK-1R 光灰度值较低；B：哮喘气道重塑组，NK-1R 光灰度值较高。

对照组ASMC 迁移数量较少，与对照组相比，哮喘气道重塑组细胞迁移数量明显增多（P＜0.01）。各浓度NK-1R 拮抗剂组细胞迁移数目较对照组增多，但较哮喘气道重塑组明显减少，而且随着WIN62577 浓度增高，ASMC 迁移数量逐渐减少（P＜0.05）。见表 3，图 4。

表 3

表 3 各组大鼠 ASMC 迁移数量比较（x±s）

表 3 各组大鼠 ASMC 迁移数量比较（x±s）

图 4

图 4 Transwell 小室检测大鼠ASMC 的迁移（苏木 素染色，×100） A：正常对照组，ASMC 的迁移数量最少；B： 哮喘气道重塑组，ASMC 的迁移数量最多；C：WIN62577 10-11 mol/L 组，ASMC 的迁移数量较哮喘气道重塑组少； D：WIN62577 10-10 mol/L 组，ASMC 的迁移数量较WIN62577 10-11 mol/L 组少；E：WIN62577 10-9 mol/L 组，ASMC 的迁移数量较WIN62577 10-10 mol/L 组少；F：WIN62577 10-8 mol/L 组，ASMC 的迁移数量较WIN62577 10-9 mol/L 组少。

在持续哮喘的病例中，ASMC 会出现向气道内膜定向移动并出现分泌功能，这一现象称为气道平滑肌的迁移性生长^[9]。Gizycki 等^[10] 发现在哮喘急性发作后24 h，气道网状部内的肌成纤维细胞数量显著增加，同时肌成纤维细胞呈现出不规则的细胞轮廓，细胞内有大量的高浓度肌丝样结构，并且有些细胞紧贴平滑肌细胞层，提示这种肌成纤维细胞很有可能是来源于平滑肌细胞，这一迁移过程可能和哮喘气道病理变化有着密切的联系，因为有证据显示，肌成纤维细胞能够分泌大量的胶原物质，使网状部增厚，并且参与调控内皮细胞与间叶细胞的相互作用、影响内皮细胞的调亡、诱导平滑肌细胞增生及气道壁的重塑^[11]。

本研究结果显示，哮喘气道重塑组ASMC 迁移数量明显增多，也提示ASMC 迁移可能是哮喘气道重构的重要促成因素。感觉神经肽SP 广泛分布于中枢和周围神经系统，在受到伤害性刺激时，SP 可逆向释放入损伤局部组织中，参与对修复细胞增殖、迁移、分化的调控^{[12, 13, 14]}。以往未见有关NK-1R 在ASMC 中的表达的报道，本研究发现，NK-1R 在大鼠ASMC 的细胞膜及细胞质中均有表达，并且哮喘气道重塑大鼠ASMC 中NK-1R的mRNA 和蛋白的表达均较对照组明显增多，这是SP 作用于ASMC 的基础和前提。

研究发现，运用NK-1R 激动剂可以显著刺激T 淋巴细胞、单核细胞的化学趋向性，当用NK-1R 的选择性的拮抗剂LY303870 时，两种细胞的化学趋向作用被显著抑制^{[15, 16]}。国内研究发现，WIN62577 可通过降低细胞内钙离子浓度改善哮喘气道高反应性^[17]，但是NK-1R 对气道重塑的影响未见报道。本研究显示，给予WIN62577 阻断NK-1R 后可以抑制ASMC 的迁移，表明NK-1R 在ASMC 迁移中起着重要作用，推断感觉神经肽SP通过与其受体（NK-1R）结合，加速ASMC 的迁移，从而促进气道重塑的发生、发展，从新的角度探讨了气道重塑的发生机制，应用NK-1R 拮抗剂从而抑制ASMC 的迁移可能是防治哮喘气道重塑的新途径，值得进一步深入研究。