中国当代儿科杂志  2015, Vol. 17 Issue (12): 1273-1276   PDF    
引用本文
朱丽娜, 王艳, 彭薇, 等.智力障碍儿童的亚端粒拷贝数变异检测[J]. 中国当代儿科杂志, 2015, 17(12): 1273-1276.  
ZHU Li-Na, WANG Yan, PENG Wei, et al. Detection of subtelomeric copy number variations in children with intellectual disability[J]. CJCP, 2015, 17(12): 1273-1276.   
智力障碍儿童的亚端粒拷贝数变异检测
朱丽娜, 王艳, 彭薇, 马秀伟, 杨晓, 刘欣, 封志纯     
北京军区总医院附属八一儿童医院, 北京 100700
收稿日期: 2015-02-10; 接受日期: 2015-04-06
作者简介: 朱丽娜,女,硕士研究生,主治医师。
通讯作者: 封志纯,男,教授,主任医师。
摘要: 目的应用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测亚端粒拷贝数变异,探讨遗传性智力障碍(ID)的发病机制。方法收集68例G-显带染色体核型分析结果正常的ID患儿,通过MLPA P036筛查亚端粒拷贝数变异。结果 68例患儿中检出亚端粒拷贝数异常者7例(10%),均为缺失突变,其中1例患儿涉及2个亚端粒的缺失变异,另1例患儿涉及4个亚端粒的缺失变异。结论亚端粒拷贝数变异是遗传性ID的重要病因;MLPA可作为研究遗传性ID患儿发病机制的经济、有效的方法。
关键词: 智力障碍     亚端粒     拷贝数变异     多重连接探针扩增     儿童    
Detection of subtelomeric copy number variations in children with intellectual disability
ZHU Li-Na, WANG Yan, PENG Wei, MA Xiu-Wei, YANG Xiao, LIU Xin, FENG Zhi-Chun     
Bayi Children's Hospital, General Military Hospital of Beijing, Beijing 100700, China
Abstract: Objective To detect subtelomeric copy number variations in children with genetic intellectual disability (ID) using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), and to investigate the pathogenesis of genetic ID. Methods A total of 68 children with ID who had normal results of G-banding karyotype analysis were included in the study. Their subtelomeric copy number variations were detected using MLPA P036. Results Among the 68 children with ID, 7(10%) showed subtelomeric copy number variations, and all the variations were deletion mutations. Among them, 1 case carried 2 subtelomeric microdeletions, and 1 case carried 4 subtelomeric microdeletions. Conclusions Subtelomeric copy number variations are important causes of genetic ID. MLPA can be used as an economic and effective method for investigating the pathogenesis of genetic ID.
Key words: Intellectual disability     Subtelomere     Copy number variation     Multiplex ligation-dependent probe amplification     Child    

智力障碍（intellectual disability, ID）是严重影响儿童身心健康、伴有明显神经系统损坏的慢性疾病，主要临床特征为认知能力和社会适应功能的缺陷，通常于18岁前发病，发病率为1%~3%[1, 2, 3]。ID病因复杂，可分为遗传性因素及非遗传性因素，在遗传性ID中，染色体数目及结构异常是最常见的病因[4]；近年来研究显示亚端粒的拷贝数变异也是重要的致病原因，占遗传性ID的5%~10%[4, 5]。

大部分染色体亚端粒区域富含基因，易于发生基因重组[6]，导致疾病发生。目前检测拷贝数变异的方法主要有微阵列比较基因组杂交（CGH）、基因分型为基础的单核苷酸多态性（SNP）、高通量二代测序、荧光原位杂交等，但以上方法检测费用昂贵、费时、费力，基层医院不易推广。多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA ）技术是一种分子遗传学诊断方法，可以检测亚端粒的重排，包括缺失及重复突变[7, 8, 9]，具有经济、高效、易于推广等优点。本研究采用MLPA技术对68例遗传性ID患儿进行了亚端粒缺失及重复突变检测，旨在探讨遗传性ID的病因及遗传学机制，对于ID的早期诊断、早期干预及遗传咨询具有重大意义。

1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2012年至2014年北京军区总医院附属八一儿童医院门诊就诊的ID患儿68例，男性42例，女性26例，年龄在1~15岁，父母临床表型正常。

纳入标准：经过智商测定确诊为中度-重度ID；无明确的脑损伤病史；染色体核型分析正常；头颅影像学检查未见明显异常；智力及语言、运动发育落后；母亲孕产史正常；家族中无智力异常者。

同时选取50例智力正常儿童作为对照组，其中男性25例，女性25例，年龄在1~15岁，本研究获得家属书面知情同意及医学伦理委员会的批准。

1.2 研究方法

标本采集：取患儿及父母以及对照组儿童外周血各1 mL。使用离心柱法（Tiangen人类血液基因组提取试剂盒）提取外周血DNA。

筛查亚端粒重排：应用MLPA-P036试剂盒（MRC-Holland公司生产，http://mrc.holland.com）检测亚端粒重排，该试剂盒可以对1~22号染色体及X/Y染色体亚端粒区域进行拷贝数变异检测。筛查结果阳性时采用MLPA-P070试剂盒对结果进行验证，该试剂盒探针同样可以检测23对染色体的亚端粒重排，但探针结合的部位不同与P036试剂盒，因此可见相互验证结果。MLPA步骤可以分为多重探针杂交、连接、多重PCR反应、毛细管电泳及数据采集，每一步骤均严格按照操作说明进行。

MLPA产物的分析与结果判定：采用ABI3130遗传分析仪对PCR扩增产物进行毛细管电泳及数据采集，并使用Genemarker1.6软件进行数据的分析。根据荧光强度峰值与对照峰值的比值判断是否存在缺失或是重复突变；根据说明书，比值小于0.7提示拷贝数减少，即缺失突变；比值大于1.3提示拷贝数增加，即重复突变；比值介于0.7~1.3之间为正常。

2 结果 2.1 一般资料

68例遗传性ID患儿中共检出亚端粒异常者7例（10%），患儿临床特征见表 1。

表 1 染色体亚端粒异常ID 患儿的临床特征
2.2 MLPA检测结果

7例染色体亚端粒异常患儿均为缺失突变，其中1例患儿（ID82）涉及2个基因（BC-2、RABL2B）的缺失突变，另1例患儿（ID26）涉及4个基因（BC-2、RABL2B、SLC6A12、SOX12）的缺失突变。在7例染色体亚端粒异常患儿中，6例是常染色体亚端粒缺失突变引起，包括：8pter、19qter、22qter、12pter、9pter和20pter；

1例患儿是性染色体亚端粒异常引起。正常对照未检测到亚端粒的异常。见表 2。

表 2 MLPA 检测结果
3 讨论 ID的病因复杂，30%~50%的ID患者病因不明[10]，随着技术FISH技术及MLPA技术的发展，发现许多不明原因的ID是由亚端粒异常引起的[11, 12]；亚端粒位于染色体末端的编码区，含有大量功能基因且易发生重组，但重组机制不明确[1]。本研究利用MLPA技术对68例ID患儿进行亚端粒重排筛查，发现7例患儿存在该区域变异，检出率为10%，与文献报道一致[7, 13]。在7例染色体亚端粒异常患儿中，6例是常染色体亚端粒缺失突变引起，包括：8pter、19qter、22qter、12pter、9pter和20pter，1例患儿是性染色体亚端粒异常引起，而在其他研究中则显示X连锁型ID占的比例较高[14, 15]，可能为本研究中的68例患儿均无异常家族史（即新发突变）导致。

本研究中，患儿ID26和ID82均存在19qter、22qter微缺失改变，部分临床症状相同，如：均具有异常面容（眼距宽、鼻梁低、唇厚、人中长）、智力低下、运动发育落后、自闭症行为、癫癎发作；患儿ID26同时存在12pter、20pter缺失改变，临床症状也更为严重，表现为耳位低、手小、短指畸形、身材矮小，自幼频繁发生抽搐，抗癫癎药物疗效不佳，患儿严重的临床表型可能是与多基因的联合缺失有关。患儿ID82除上述临床症状外，还患有先天性室间隔缺损，先天性心脏病是由于上述亚端粒缺失突变引起，还是环境与基因共同作用致病，目前还难以确定。患儿ID63和ID75均具有19qter缺失，均表现为智力低下，ID63同时还表现为小头畸形及异常面容（双眼斜视、眼距宽、鼻梁低、人中长），与ID26和ID82相似。本研究中，4例患儿均具有19qter缺失，其中3例患者异常面部表型相似，是否为相关基因缺失改变导致的特征性面容，还需进一步研究证实。文献报道，9pter缺失综合征典型的临床表现包括智力低下、三角头畸形及性逆转[16]，但本研究中患儿ID51仅仅表现为智力低下，不伴随其他畸形及性别发育异常。亚端粒拷贝数变异引起遗传性ID临床症状复杂，具有同质异型性，很难找到一种特征性临床表现来区分是某种亚端粒变异所致，影响临床表型的因素多种多样，包括缺失片段的大小、变异所在的染色体位置、缺失片段所含的基因数目及相关片段是否存在三体等。

目前，检测拷贝数变异的技术主要包括：微阵列比较基因组杂交技术、单核苷酸多态性基因分型为基础的阵列技术及第二代高通量测序技术，但是这些方法操作成本高、价格贵，生物信息学分析难度大、难推广；MLPA技术具有灵敏、高效、省时、省力的特点，易于推广应用，可以作为筛查亚端粒重组的一种常规检测技术。

参考文献
[1] Medina A, Pineros L, Arteaga C, et al. Multiplex ligationdependent probe amplification to subtelomeric rearrangements in idiopathic intellectual disability in Colombia[J]. Pediatr Neurol, 2014, 50(3):250-254.
[2] Perou R, Bitsko RH, Blumberg SJ, et al. Mental health surveillance among children--United States, 2005-2011[J]. MMWR Surveill Summ, 2013, 62 Suppl 2:1-35.
[3] Michelson DJ, Shevell MI, Sherr EH, et al. Evidence report:Genetic and metabolic testing on children with global developmental delay:report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society[J]. Neurology, 2011, 77(17):1629-1635.
[4] 季涛云, 吴晔, 王静敏, 等. 检测不明原因智力障碍/脑发育迟缓儿染色体亚端粒重组突变[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志, 2011, 30(3):173-177.
[5] Shevell M, Ashwal S, Donley D, et al. Practice parameter: evaluation of the child with global developmental delay: report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and The Practice Committee of the Child Neurology Society[J]. Neurology, 2003, 60(3):367-380.
[6] Mefford HC, Trask BJ. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres[J]. Nat Rev Genet, 2002, 3(2): 91-102.
[7] Wu Y, Ji T, Wang J, et al. Submicroscopic subtelomeric aberrations in Chinese patients with unexplained developmental delay/mental retardation[J]. BMC Med Genet, 2010, 11:72.
[8] Jehee FS, Takamori JT, Medeiros PF, et al. Using a combination of MLPA kits to detect chromosomal imbalances in patients with multiple congenital anomalies and mental retardation is a valuable choice for developing countries[J]. Eur J Med Genet, 2011, 54(4):e425-e432.
[9] 杨月华, 胡娅莉, 朱湘玉, 等. 多重连接探针扩增技术在先天性心脏病22q11微缺失/微重复综合征诊断中的应用[J]. 中国当代儿科杂志, 2009, 11(11):892-896.
[10] de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, et al. Diagnostic genome profiling in mental retardation[J]. Am J Hum Genet, 2005, 77(4):606-616.
[11] Flint J, Wilkie AO, Buckle VJ, et al. The detection of subtelomeric chromosomal rearrangements in idiopathic mental retardation[J]. Nat Genet, 1995, 9(2):132-140.