T 细胞是机体特异性免疫系统的主要组分之一，通过细胞免疫参与机体抗感染、自身免疫性疾病、肿瘤发生等多种疾病过程，具有重要的生物学功能。T细胞参与类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化的发病过程，临床上抑制T细胞活性的药物在上述疾病的治疗中已经被广为使用。因此，T细胞的活化、增殖、分化、细胞因子的分泌等生物学功能对机体的免疫状态有重要影响。T细胞通过T细胞表面受体（T cell receptor, TCR，第一信号）、共刺激分子（第二信号）、其他细胞因子和趋化因子（第三信号）共同作用， 经过复杂的信号通路发生级联反应，最终实现上述生物学功能^{[1, 2, 3]}。

蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）是T细胞内信号通路中的重要分子。在T细胞内，存在PKC-α，β，θ，ε，δ，ζ，η，ι 8种亚型^[4]。其中，PKCθ是目前被研究得最透彻的亚型。它选择性地表达于T细胞，是效应性T细胞内唯一被募集于免疫突触内的亚型，在TCR刺激下的NF-κB、AP-1、NFAT信号通路的活化过程中起关键作用，参与类风湿性关节炎、炎症性肠病、移植物排斥反应等疾病过程^{[5, 6, 7]}。T细胞内另一表达量较多的亚型PKCα对T细胞的功能也有重要影响；过表达PKCα的胸腺细胞在TCR信号刺激下增殖更快，生成的IL-2更多^[6]，PKCα参与调节T细胞在 TCR信号刺激后的IL-2受体表达^[7]；PKCα与PKCθ在TCR下调过程中有叠加作用^[8]。在CD3/CD28信号活化NF-κB过程中，PKCα作用于PKCθ上游^[9]，PKCα与PKCθ双敲除的小鼠较PKCθ单敲除小鼠在心脏移植实验中移植物存活时间明显延长^[10]。因此，进一步研究PKCα在T细胞中的功能具有重要意义。在PKCα基因敲除的小鼠中，T、B细胞的发育正常，但TCR/CD28信号诱导的T细胞增殖、IFNγ生成以及IgG2a/2b反应受到明显抑制^[11]。到目前为止，PKCα是否参与调控T细胞的其他多种生物学过程并不清楚。

本研究利用PKCα基因敲除小鼠，全面分析了PKCα对T细胞增殖、凋亡、分化、细胞因子的生成、诱导性调节性T细胞（iTreg）生成的影响，为PKCα在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤发病中的作用研究提供了新的思路。

实验所用PKCα基因敲除小鼠（B6）购自美国杰克逊实验室，采用RT-PCR、Western-blot检测，获取合格的8~10周龄野生型（PKCα^+/+组）和基因敲除纯合子（PKCα^-/-组）小鼠用于本实验。T细胞、CD4⁺T细胞富集柱均购自美国R&D公司。仓鼠抗-小鼠CD3、CD28抗体购自美国BD公司，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CSFE）细胞增殖试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，流式细胞技术所用全部抗体及试剂盒、所有ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司。

断颈处死野生型（PKCα^+/+组）或基因敲除纯合子（PKCα^-/-组）小鼠（每组每次2~3只），无菌分离脾脏及肠系膜淋巴结，研磨组织取得单细胞悬液并离心。将红细胞裂解液加入上述单细胞沉淀，冰上作用5 min裂解红细胞，终止反应并离心得到白细胞沉淀。为了提高分离效率和保证细胞活力，研磨和终止红细胞裂解液使用含10%FBS 的RPMI 1640。按照说明书使用T细胞富集柱分离T细胞，计数，调整T细胞浓度。将PKCα^+/+组或PKCα^-/-组T细胞种植于提前包被了抗-小鼠CD3或CD3+CD28抗体的24孔培养板内，培养48 h后收集上清用ELISA的方法检测细胞因子；或照上述方法将T细胞种植于96孔培养板内，培养72 h，在培养的最后18 h向培养基中加入³H胸腺嘧啶，收集细胞检测T细胞增长情况。CSFE可被动扩散进入细胞，分解后形成的琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定的荧光偶联物，随细胞分裂而被稀释至子细胞中。在增殖实验中，分离T细胞后，按照说明先用CSFE预染T细胞，培养72 h后，再结合Annexin V染色用流式细胞术分析增殖与凋亡结果。体外刺激后的细胞增殖、细胞因子生成实验至少重复3次以上，每次实验设3个复孔。

断颈处死野生型或纯合子小鼠，按照说明书使用CD4⁺T细胞富集柱分离PKCα^+/+组或PKCα^-/- 组CD4⁺T细胞，计数，调整细胞浓度。用抗-CD3抗体（2 μg/mL）刺激，在抗原提呈细胞存在的条件下，用Th17细胞的分化条件进行培养：人源化的TGF-β（5 ng/mL, R&D Systems）加上IL-6（20 ng/mL, PrepoTech, Rocky Hill, NJ），IL-4（11B.11, 10 mg/mL）和IFN-γ（XMG1.2, 15 mg/mL）的抗体。染色前先用PMA+Ionomycin对细胞预处理5 h。iTreg的培养条件：抗-CD3抗体（1 μg/mL）、抗-CD28抗体（1 μg/mL）、IL-2（2.5 ng/mL）及TGF-β（100 u/mL）。培养3 d后收集细胞进行染色。体外分化实验至少重复3次以上，每次设3个复孔。

收集体外分化的细胞，先用抗-CD4抗体（Th17）和抗-CD25抗体（iTreg）进行细胞表面的染色，用试剂盒中的固定打孔液进行固定和打孔，再用抗-小鼠IL-17、IFN-γ和Foxp3抗体进行胞内染色，在LSR II流式分析仪上检测标本，用FlowJo软件进行结果分析。

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。呈正态分布计量资料采用均数±标准差（ x±s）的形式表示，两组间比较采用Student's t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

在单有CD3或同时有CD28刺激信号（CD3+CD28）时，PKCα^-/-组T细胞的增长较PKCα^+/+组明显减低（P<0.01）（图 1A，表 1）。由于这种增长是细胞分裂、凋亡、死亡的综合结果，因此采用流式细胞术进一步验证T细胞的增殖或凋亡，在CD3+CD28信号共刺激下，PKCα^+/+组T细胞分裂增殖显著快于PKCα^-/-组T细胞（P<0.05），提示PKCα对TCR信号诱导下T细胞增殖有促进作用；同时，Annexin V阳性的细胞数量在PKCα^+/+组与PKCα^-/-组T细胞间比较差异无统计学意义（P>0.05），提示PKCα对TCR信号诱导下T细胞的凋亡影响不大（图 1B，表 2）。

图 1 T 细胞体外增殖结果 A：3H 胸腺嘧啶掺入法检 测T 细胞体外增殖结果（n=3）：a 示与PKCα+/+ 组比较，P<0.01。 B：流式细胞术检测T 细胞体外增殖与凋亡结果：预先用CSFE 标 记的T 细胞在CD3+CD28 抗体存在时增殖明显，与PKCα+/+ 组相比， PKCα-/- 组T 细胞增殖减低（左下象限），但凋亡在两组中差异不 明显（左上+ 右上象限）。

表 1(Table 1)

表 1 3H 胸腺嘧啶掺入法检测T 细胞体外增殖结果

表 1 3H 胸腺嘧啶掺入法检测T 细胞体外增殖结果

表 2(Table 2)

表 2 流式细胞术检测T 细胞体外增殖与凋亡结果

表 2 流式细胞术检测T 细胞体外增殖与凋亡结果

单有CD3刺激信号时，两组IL-2生成量少，差异不明显（P>0.05）；CD3+CD28共刺激时，PKCα^-/- 组IL-2生成反而较PKCα^+/+组增多（P<0.01）（图 2A，表 3）。PKCα^-/- 组在CD3+CD28信号共刺激下IL-4、 IL-17的生成较PKCα^+/+组受到明显抑制（P<0.01）（图 2C、D，表 3）。两组IFN-γ无论在CD3单刺激还是在的CD3+CD28共刺激时差异均无统计学意义（P>0.05）（图 2B，表 3）。提示PKCα对TCR信号下IL-2的生成起抑制作用，对IL-4 、IL-17的生成起促进作用，对IFN- γ的生成无明显影响。

图 2 ELISA 法检测体外培养T 细胞中细胞因子生成情况（n=3） A~D 分别为两组IL-2、IFN-γ、 IL-4、IL-17 在不同条件下的变化比较。a 示与PKCα+/+ 组比较，P<0.05。

表 3(Table 3)

表 3 CD3+CD28 共刺激下细胞因子生成情况比较

表 3 CD3+CD28 共刺激下细胞因子生成情况比较

在TGF-β存在的条件下，PKCα^-/-组iTreg（CD25⁺Foxp3⁺）生成较PKCα^+/+组明显增多（P<0.05）（图 3A，表 4），而Th17细胞较PKCα^+/+组明显减少（P<0.05）（图 3B，表 4），提示PKCα抑制iTreg生成、促进Th17分化。

在TCR和各种细胞因子介导的信号下，外周CD4⁺T细胞可以分化成至少4个主要的亚群：辅助T细胞Th1、Th2、Th17和iTreg，它们分别由各自的转录因子调控，产生不同的特征性细胞因子，具有不同的功能，协同作用在机体面对各种病原体产生的适应性免疫反应中起关键作用。其中，CD4⁺T细胞在IL-12、IFN-γ诱导下，转录因子T-bet/STAT4被活化而分化成产生IFN-γ的Th1细胞，参与机体细胞内病毒、细菌感染免疫；在IL-4等细胞因子存在时，转录因子GATA3/STAT6被活化而分化成产生IL-4的Th2细胞，参与细胞外寄生虫感染免疫；在TGF-β、IL-6存在时，转录因子RORγt、STAT3被活化而分化成生成IL-17的Th17细胞，参与细胞外细菌与真菌感染免疫；3种Th细胞过度活化时均可引起相应的自身免疫性疾病。而TGF-β与IL-2同时存在时，CD4⁺T细胞分化成表达转录因子Foxp3的调节性T细胞，抑制过度免疫反应，维持机体外周免疫稳态^{[12, 13]}。

本研究全面地分析了PKCα对CD4⁺T细胞分化的影响，结果显示，PKCα缺失时，TCR信号下 IL-4、IL-17的生成减少，且Th17分化受到抑制，iTreg生成明显增多，而IFN-γ的生成则变化不明显，提示PKCα促进Th2、Th17的分化，抑制iTreg的生成。

本课题组已有的结果显示，PKCα通过磷酸化Akt分子Ser⁴⁷³位点参与T细胞内TCR刺激下 PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化^[14]。Th2细胞参与哮喘及多种呼吸道高敏反应。Cook等^[15]的研究证实，TCR刺激通过活化PI3K/mTOR信号通路增加GATA-3蛋白的翻译来促进Th2细胞的分化；Oh等^[16]的研究表明，在对粉尘螨过敏病人的T细胞中，粉尘螨过敏原Der f2通过活化PKCα来激活膦脂酶D；Robert等^[17]报道，电压门控钙离子通道Cav 1.2选择性地表达于Th2细胞上，降低Cav 1.2表达可抑制Th2细胞的功能和实验性哮喘的发生，而这种调控是PKCα/β依赖性的。Th17细胞参与牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化等多种自身免疫性疾病的发生，而iTreg功能失衡亦是牛皮癣发病的一个重要机制^[18]。He等^[19]研究表明，泛-PKC抑制剂（AEB071）能抑制TCR/CD28诱导的T细胞活化和炎症性细胞因子包括IL-17A的生成并且保留稳定的调节性T细胞的表型，它已经在牛皮癣的临床试验中显示一定的疗效。而Chen等^[20]的研究则证实，牛皮癣病变环境中常见的趋化因子CCL3，高浓度时通过提高Akt Ser473的磷酸化程度来促进Foxp3的降解从而调节调节性T细胞的稳定性。因此，PKCα可能是通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路来调控Th2、Th17、iTreg细胞的分化。

与Pfeifhofer 等^[11]的结果一致，本研究利用³H胸腺嘧啶掺入法发现PKCα促进TCR信号下T细胞的增长，利用CSFE预染色结合Annexin V染色的方法，进一步证实这种增长是由细胞分裂引起的增殖而不是由凋亡所致的。本研究结果表明PKCα缺失时IL-2的生成反而增多，与他们的结果亦不冲突。本研究还表明PKCα对 TCR信号下IFN-γ生成影响不显著，与Pfeifhofer等^[11]的结果不一致，可能与抗原的刺激强度或小鼠背景有关，其具体机制需进一步探讨 。

总之，尽管具体分子机制及信号通路仍不清楚，本研究显示PKCα促进T细胞增殖，Th2、Th17细胞的分化，抑制iTreg的生成，呈促炎的特性，可能参与细胞外寄生虫、细菌与真菌抗感染免疫以及哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病。进一步的在体研究将为这些疾病的早期诊断及治疗提供新的方向。