哮喘的发生涉及多个基因的紊乱^[3,4]。CHI3L1基因是一种新发现的哮喘相关基因，位于人类染色体 1q31-q32 的高度保守区，基因组 DNA 长约10.9 kb，基因组结构显示其由分布于8 kb 区域上的 10 个外显子构成。CHI3L1 基因在人体内广泛表达，其编码蛋白 YKL-40 是一种几丁质酶样蛋白，其主要功能是水解环境中多余的几丁质聚合物。几丁质酶在免疫反应中起着非常重要的作用。例如，Hong 等^[5] 发现几丁质酶能够激活呼吸道上皮细胞的蛋白酶活化受体 2。近来研究表明，YKL-40 的表达水平与哮喘的发生发展有着密切的关系^[6]。CHI3L1 基因具有多个多态位点，现已发现超过 200 个，遍布于 CHI3L1 基因的全长^[7]，部分 CHI3L1 基因变异位点最近被证实与哮喘易感性相关。随着对 CHI3L1 基因在哮喘中作用及机制的研究不断深入，有可能在将来为哮喘的风险提前预估提供一个新的生物指标，为哮喘的防治提供新的思路与方法。目前，CHI3L1 单核苷酸多态性（SNP）主要研究对象大多数为欧美人群，国内相关哮喘基因多样性的研究相对较少。本研究拟对CHI3L1 基 因 的 SNP 位 点 rs4950928、rs10399805和 rs883125 进行检测分析，为儿童哮喘的早期干预、个性化诊断和治疗寻找新的方向。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2011年1月至2013年10月确诊的0~6 岁支气管哮喘患儿 316 例为研究对象，诊断标准依据中华医学会呼吸病分会哮喘学组 2013 年制定的《支气管哮喘防治指南（基层版）》^[8]，其中男164 例，女 152 例，平均年龄 2.2±1.4 岁；同期选取 297 例无咳嗽、咳痰等呼吸道症状，无哮喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎等过敏性疾病，且父母无过敏史的 0~6 岁健康儿童为对照组，其中男 152例，女 145 例，平均年龄 2.3±1.5 岁。两组儿童相互间无血缘关系；且平均年龄和性别分布差异均无统计学意义，具有可比性。抽血前填写一般资料调查表，所有信息的采集均严格按照相应伦理规章制度执行。 1.2 主要仪器与试剂

总 IgE 测 定 采 用 美 国 Beckman 公 司 的 DXI-800 化学发光仪；嗜酸性粒细胞比例测定使用日本Sysmex 公司的 XS-500i 血细胞分析仪；YKL-40 测定采用美国 CUSABIO 公司的 ELISA 试剂盒；SNP位点的检测分析使用 Sequenome 公司的相关反应试剂和 MALDI-TOF 质谱仪。 1.3 样本采集

分别采集两组研究对象 2 mL 外周血，其中1 mL 血样采用化学发光法和流式细胞术分别检测总 IgE 水平和嗜酸性粒细胞比例；另外 1 mL 血样以 4℃ 3 000 rpm 离心 20 min 分离血浆和血细胞，分离的血浆应用 ELISA 法检测 YKL-40 水平，血细胞提取基因组 DNA 进行质谱分析。 1.4 总 IgE 浓度和嗜酸性粒细胞比例测定

总 IgE 浓度和嗜酸性粒细胞比例测定均采用配套试剂，按照 DXI-800 化学发光仪和 XS-500i 血细胞分析仪的标准操作程序进行自动化检测。 1.5 血浆 YKL-40 检测

YKL-40 测 定 采 用 美 国 CUSABIO 公 司 的ELISA 试剂盒，具体步骤按照说明书进行操作。 1.6 SNP 分型检测

采 用 Mass ARRAY-IPLEX质谱阵列技术对CHI3L1 基因的 SNP 位点 rs10399805、rs4950928 和rs883125 进行检测。提取各样本血细胞基因组 DNA行 PCR 扩增，引物序列见表 1。PCR 反应结束后对各样本进行纯化回收，树脂脱盐后用 Nanodispenser点样，将点好样的芯片放入质谱仪中打质谱。

表 1(Table 1)

表 1 SNP 位点的引物序列

表 1 SNP 位点的引物序列

采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数 ± 标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用方差分析；不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）] 表示，两组间比较采用 Mean-Whitney U检验，多组间比较采用 Kruskai-Wallis H检验；基因频率采用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 两组血浆 YKL-40 水平的比较

哮喘组患儿血浆 YKL-40 浓度为 59.30（34.21，89.51）ng/mL，显著高于对照组血浆 YKL-40 水平 [26.17（15.18，38.57）ng/mL]（U=19441.5，P<0.001）。 2.2 两组嗜酸性粒细胞比例和总 IgE 浓度的比较

哮喘组嗜酸性粒细胞比例 [1.52％（0.48％，2.62％）] 与对照组 [1.58％（0.53％，2.54％）] 比较差异无统计学意义（U=49051.5，P=0.332）；哮喘组总 IgE 水平 [351.35（100.93，611.23）IU/mL]明 显 高 于 对 照 组 [33.38（19.27，53.30）IU/mL，U=8947，P<0.001]。 2.3 CHI3L1 基因 SNP 位点在两组间的分布频率

CHI3L1 基 因 SNP 位 点 rs10399805、rs4950928 和 rs883125 基 因 型 均 符 合 HardyWeinberg 平衡定律。rs10399805 位点在两组间的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义（均P>0.05）。rs4950928 位点的 CC 基因型在哮喘组中的频率低于对照组（P<0.01），而 CG 基因型频率则高于对照组（P<0.01），且 C 和 G 等位基因频率在两组间差异有统计学意义（P<0.001）。rs883125 位点的 GG 基因型在哮喘组中的频率高于对照组（P<0.001），且 C 和 G 等位基因频率在两组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2~4。

表 2(Table 2)

表 2 两组 CHI3L1 基因 rs10399805 位点基因型及等位基因频率比较 [例（%）]

表 2 两组 CHI3L1 基因 rs10399805 位点基因型及等位基因频率比较 [例（%）]

表 3(Table 3)

表 3 两组 CHI3L1 基因 rs4950928 位点基因型及等位基因频率比较 [例（%）]

表 3 两组 CHI3L1 基因 rs4950928 位点基因型及等位基因频率比较 [例（%）]

表 4(Table 4)

表 4 两组 CHI3L1 基因 rs883125 位点基因型及等位基因频率比较[例（%）]

表 4 两组 CHI3L1 基因 rs883125 位点基因型及等位基因频率比较[例（%）]

根据上述结果提示，rs4950928 和 rs883125 可能是导致儿童哮喘发作的易感因子。因此本研究对 rs4950928 和 rs883125 中多个基因型与哮喘指标之间的关系进行进一步比较研究。

血浆 YKL-40 和总 IgE 浓度在 rs4950928 位点不同基因型患儿中差异均有统计学意义，且基因型为 GG 或 CG 的哮喘患儿血浆 YKL-40 和总 IgE浓度均高于基因型为 CC 的患儿（均P<0.05）；而嗜酸性粒细胞比例在 rs4950928 位点不同基因型患儿间差异无统计学意义（P>0.05），见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 rs4950928 位点不同基因型患儿哮喘各指标水平的比较 [P50(P25,P75)]

表 5 rs4950928 位点不同基因型患儿哮喘各指标水平的比较 [P50(P25,P75)]

血浆 YKL-40 水平、总 IgE 浓度和嗜酸性粒细胞比例在 rs883125 位点不同基因型患儿中差异均无统计学意义（均P>0.05），见表 6。

表 6(Table 6)

表 6 rs883125 位点不同基因型患儿哮喘各指标水平的比较[P50(P25,P75)]

表 6 rs883125 位点不同基因型患儿哮喘各指标水平的比较[P50(P25,P75)]

哮喘是最常见的儿童慢性疾病之一，2009~2010 年的抽样调查显示，我国城市儿童哮喘患病率为 3.02%（95%CI：2.97%~3.06%），2 年哮喘现患率则为 2.32%（95%CI：2.28%~2.37%）^[1]。哮喘是一种多基因遗传病，其多基因遗传的方式十分复杂。本研究通过对 316 名哮喘患儿和 297 名健康儿童的 CHI3L1 基因位点 rs10399805、rs4950928和 rs883125 进行单核苷酸多态性分析，结果表明：CHI3L1 基因的 rs4950928 和 rs883125 多态性可能是儿童哮喘的易感因子，而 rs10399805 可能并非儿童的哮喘易感基因。rs883125 位点的 GG 基因型可能提高携带儿童患哮喘的风险；rs4950928 的C 等位基因可能对哮喘患儿起到了一定的保护作用，而 G 等位基因则可能是提高哮喘风险的易感因子；此外本研究还发现，哮喘组血液中的总 IgE和 YKL-40 水平明显高于对照组。

rs10399805 总共有 TT、CT 和 CC 三种基因型，本研究中这三个基因型频率在哮喘患儿和健康儿童中的分布差异无统计学意义。针对 rs10399805作用的研究目前尚存争议。在 2009 年针对韩国儿童的调查显示，rs10399805 T 等位基因在过敏患者中相比正常人有显著提高，同时伴有 YKL-40 水平的升高^[9]。针对欧美人群的研究则表明，尽管rs10399805 T 等位基因仍能提高 YKL-40 水平，然而该位点与过敏之间的联系仍有待确认^[10]。我国学者 2011 年最新研究报告则显示，rs10399805 甚至与外周血 YKL-40 水平的提高无明显联系^[11]。由此可知，rs10399805 是否是哮喘的易感基因，其在哮喘中所起的作用仍是一个未知数，仍有待研究。

rs883125 总共 CC、CG 和 GG 三种基因型，在本研究中哮喘患儿 GG 基因型的频率远远高于健康儿童，表明 GG 基因型可能提高携带儿童患哮喘的风险。在哮喘患者 rs883125 位点各基因型的对比中，其 YKL-40、总 IgE 水平和嗜酸性粒细胞比例无明显差异，这表明 G 等位基因对于 YKL-40 和总 IgE 的升高并无明显影响，因此其对疾病的严重程度影响可能与 C 等位基因并无差别。

rs4950928 位于 CHI3L1 基因的启动子上，其变异与一系列的疾病有关，其可能是哮喘的易感基因之一^[12,13]，然而具体作用方式仍有待于进一步的研究。Rathcke 等^[14]针对 6 514 名丹麦成人样本的研究发现 rs4950928 G 等位基因是哮喘的易感因子。有学者针对 G 等位基因对于基因表达的作用进行了深入的研究，发现在荧光素酶报告基因检测实验中，带有 rs4950928、-131G 的基因，相比-131C 具有更高的转录活性，同时在外周血中也检测出了更高的相应 mRNA^[15]。本研究结果表明，rs4950928 的 CC 基因型在哮喘组中的频率和对照组相比下降了 12.3%，而 CG 基因型反而上升了 11.2%，两种基因型频率的改变均具有统计学意义。本研究又比较了不同基因型患儿嗜酸性粒细胞比例、YKL-40 和总 IgE 的水平，结果发现，除了嗜酸性粒细胞比例在 3 个基因型中分布基本一致外，携带 CC 基因型的哮喘患儿均伴随着相对较低的 YKL-40 和总 IgE 水平，提示在儿童人群中，rs4950928 的 C 等位基因可能对哮喘起到的保护作用，而 G 等位基因则是哮喘的易感因子。

综上所述，本研究发现CHI3L1基因rs4950928 和 rs883125 这两个 SNP 位点可能是儿童哮喘的易感基因，该结果可为儿童哮喘的早期预防、个体化诊断和治疗寻找新的方法和依据。