双歧杆菌是人体肠道里最早出现的肠道微生 物之一^[1]，是婴儿肠道微生物的优势菌，也是人体 肠道内最主要的有益菌之一，对维持人体健康有 着极其重要的作用。双歧杆菌不仅具有营养功能，如产生维生素，同时还具有抗感染、抗癌作用； 双歧杆菌通过促进肠道黏膜 SIgA 系统的成熟等机 制促进婴儿免疫系统的发育和成熟^{[2, 3, 4]}。因此，双 歧杆菌的正常发育，即在合适的时间定植合适的 双歧杆菌，对婴儿的健康成长有着重要的意义。

双歧杆菌的定植受很多因素的影响，如生产 方式、喂养方式、孕周、抗生素的使用、环境地 域等^[5]。国内对婴儿早期肠道双歧杆菌的定植情况 及动态变化的相关研究很少，且双歧杆菌检测种 类少、检测时间点选择代表性不够，在婴儿双歧 杆菌的定植方式及特点上还存在许多不明的地方。 为了解婴儿肠道双歧杆菌群构建的规律，本研究 首次采用分离培养法结合分子生物学方法，对婴 儿早期肠道中双歧杆菌种群构造进行了全面系统 的分析，拟为进一步深入探讨双歧杆菌对婴儿健 康的影响提供有益的基础数据。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2013 年3~4 月间于四川大学华西第二医 院出生的正常足月新生儿为观察对象。纳入标准： 居住在成都市五城区；胎龄37~42 周；出生体重 2 500~4 000 g；无先天性异常或出生缺陷。排除标 准：母亲产前1 个月内使用过抗生素；父母有结 核病、乙肝、艾滋病等传染性疾病；母亲有胃肠 道疾病；母亲患有重大疾病；新生儿因病理性黄疸， 新生儿肺炎等疾病服用抗生素或微生态制剂。本 研究遵循Helsink 原则，由纳入研究的新生儿父亲 或母亲签署知情同意书。共募集到28 名孕妇生产 的30 例新生儿（包括两对双胞胎），其中16 例 完成3 个月追踪调查纳入本研究：包括男7 例， 女9 例；剖腹产13 例，顺产3 例；母乳喂养7 例， 混合喂养9 例。另外14 例新生儿（包括两对双胞胎） 因新生儿疾病或其他原因退出调查。 1.2 材料和试剂

粪便稀释液的配制： 将4.5 g KH₂PO₄、 6.0 g Na₂HPO₄、0.5 g L- 半胱氨酸盐酸盐、0.5 g Tween-80 和1.0 g 琼脂混合于1 000 mL 蒸馏水中， 121 ℃ 20 min 高压灭菌；BL 培养基（BL agar） 和TOS 培养基（TOS Propionate agar） 为日本荣 研化学株式会社产品；MRS 培养基为北京陆桥公 司产品；厌氧产气袋为日本三菱化学株式会社产 品；双歧杆菌标准菌株购于日本理化学研究所微 生物保存施设（Japan Collection of Microorganism, JCM）： 青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis,B. adolescentis）ATCC15703、长 双歧杆菌（Bifidobacterium longum,B. longum） ATCC15707、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve, B. breve）ATCC15700、婴儿双歧杆菌 （Bifidobacterium infantis,B.infantis） ATCC15697、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,B. bifidum）ATCC29521、链状双歧杆菌 （Bifidobacterium catenulatum,B. catenulatum） ATCC27539、角双歧杆菌（Bifidobacterium angulatum,B. angulatum）ATCC27535、齿双 歧杆菌（Bifidobacterium dentium,B. dentium） ATCC27534；2×Taq MasterMix（ 含染料） 为北 京康为世纪科技有限公司产品；引物合成由大连 TaKaRa 公司完成；PCR 仪、电泳仪及紫外凝胶成 像系统均购自美国BIO-RAD 公司。 1.3 一般资料及样本采集

对纳入的对象进行问卷调查（包括分娩方式、 喂养方式、婴儿性别、婴儿健康状况及用药情况 等）。分别收集婴儿出生后第1 次、第2、4、7、 10、14、28、90 天共8 次粪便于单独灭菌的螺旋 式粪便盒。采样后立即送检，如不能立即检测， 则厌氧4℃保存，当日检测。 1.4 双歧杆菌的分离

采用文献^[6] 的方法，对采集的粪便中双歧杆 菌进行分离培养。称取粪便0.5 g，加入4.5 mL 的 粪便稀释液，振荡混匀，并作10 倍系列稀释。 取适宜浓度的混合液各100 μL，均用L 型玻璃棒 均匀涂布于BL 平板（含5% 马血），37℃厌氧 培养48~72 h。根据双歧杆菌在非选择性培养基 BL 平板上生长的独有特征（中央棕色且边缘部分 呈棕红色，圆形，隆起，边缘整齐，表面光滑湿 润，直径3~5 mm），从最高稀释倍数的BL 平板 上，分别挑取具有不同特征的可疑菌落接种于双 歧杆菌选择性培养基TOS 平板，置于37℃厌氧 培养48 h。挑取TOS 平板上的细菌进行革兰染色 并在显微镜下观察细菌形态，镜检为革兰阳性杆 菌，着色不均，弯曲，一端或两端膨大、分叉， 无芽孢且接种于MRS 平板，37℃需氧培养48 h 后细菌严格厌氧的菌株，初步判定为双歧杆菌，用 11%~12% 灭菌的脱脂奶对菌株进行保存。 1.5 双歧杆菌的PCR 鉴定

用煮沸法提取细菌DNA：从平板培养基上 挑取适量细菌于100 μL TE Buffer（10 mM Tris- HCl，1 mM EDTA，pH=8.0），95 ℃ 加热5 min， 10 000 r/min 离心3 min，吸取上清液，即为细菌 DNA。根据文献^[7]，合成双歧杆菌属及8 种不同的 双歧杆菌种引物（表 1）。PCR 扩增条件：94℃预 变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸2 min。PCR 扩 增产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳法。

表 1(Table 1)

表 1 双歧杆菌属/ 种PCR 特异性引物

表 1 双歧杆菌属/ 种PCR 特异性引物

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计数资料用百分率表示，组间比较采用卡方 检验或Fisher 确切概率法，P<0.05 为差异有统计 学意义。 2 结果 2.1 婴儿双歧杆菌的定植时间

16 例新生儿的第1 次、第2 天粪便中均未检 出双歧杆菌；第4、7 天分别采集到13 例新生儿 粪便，双歧杆菌定植率均为8%（1/13）；随即双 歧杆菌迅速定植，第28 天时共采集到13 例新生 儿粪便，双歧杆菌定植率增至54%（7/13），与第 4 天定植率相比，差异有统计学意义（P=0.03）； 3 月龄时共采集到15 例婴儿粪便，双歧杆菌定 植率达到60%（9/15），明显高于第4 天定植率 （P=0.006）。检出双歧杆菌的粪便里，双歧杆菌 的数量为1.0×10⁹~2.0×10¹¹ CFU/g 粪便（双歧杆 菌检出限≥ 10⁵ CFU/g 粪便）。 2.2 婴儿双歧杆菌菌种的变化

16 例婴儿的双歧杆菌菌种构成及变化分析结 果如图 1 所示。婴儿肠道内双歧杆菌菌种由最开 始单一的B. bifidum 逐步演变为多个菌种并存， 随着时间推移逐渐检出B. catenulatum、B. breve、 B. infantis、B. longum、B. dentium 及B. angulatum， 未检出B. adolescentis。成人型双歧杆菌 B. catenulatum 定植时间早于婴儿型双歧杆菌 B. infantis。第14 天时首次出现B. infantis，数量为1.0×10⁸ CFU/g 粪便，而3 个月时B. infantis 则 增长到1.0×10⁹~1.1×10¹¹ CFU/g 粪便。

图 1 婴儿肠道双歧杆菌定植种类随时间的变化

婴儿个体之间双歧杆菌定植的种类差异较大。 至3 月龄时，除了3 例婴儿未检出双歧杆菌外， 10 例婴儿肠道中定植的双歧杆菌种类总数不超过 2 种，仅3 例婴儿双歧杆菌种类总数超过2 种，最 多为4 种。因婴儿双歧杆菌定植不稳定，个别婴 儿肠道双歧杆菌在不同的时间点出现种类交替， 16 例婴儿中，6 例出现过2 种及以上双歧杆菌定植， 最早1 例发生在生后第14 天，有4 例在生后第 28 天被检出，1 例在3 月龄时被检出。 2.3 双歧杆菌菌种组成

从婴儿肠道分离鉴定的双歧杆菌共152 株， 除B. adolescentis 未检出外，双歧杆菌菌种为 B. breve 34 株（22.4%）、B. longum 31 株（20.4%）、 B. bifidum 21 株（13.8%）、B. catenulatum 19 株 （12.5%）、B. infantis 15 株（9.9%）、B. dentium 15 株（9.9%）、B. angulatum 2 株（1.3%），其他 15 株（9.9%）。 2.4 喂养方式和生产方式对婴儿双歧杆菌定植的影响

生后第10 天时9 例混合喂养新生儿中只有 1 例（11%）检出双歧杆菌，而同期7 例母乳喂养 新生儿中有3 例（43%）检出双歧杆菌定植；到3 个月时，混合喂养儿中已有5 例（56%）婴儿定植 双歧杆菌，母乳喂养儿有4 例（57%）检出双歧杆 菌。3 例顺产婴儿中，有1 例（33%）至3 月龄仍 未检出双歧杆菌，2 例（67%）仅检出一种双歧杆菌， 分别为B. bifidum 和B. infantis；13 例剖腹产婴儿 中，在生后10 d 时已有4 例（31%）检出双歧杆菌， 28 d 时有7 例（54%）检出双歧杆菌定植，并由单 一的B. bifidum 演变为多个菌种并存，仅1 例（8%） 剖腹产婴儿至3 月龄仍未检出双歧杆菌。 3 讨论

双歧杆菌是婴儿（尤其是母乳喂养儿）肠道 菌群中的优势菌群，可合成维生素，减缓过敏性 皮炎的症状，减少腹泻、病毒性感染并减轻乳糖 不耐受，尤其在婴儿免疫功能发育方面起着不容 忽视的作用^[2]。目前为止的研究表明，双歧杆菌作 为婴儿肠道首批定植的细菌之一，紧随在葡萄球 菌、链球菌和肠杆菌等需氧菌或兼性厌氧菌定植 之后，是婴儿肠道内定植最早的专性厌氧菌之一。 婴儿出生后数小时内，双歧杆菌即开始在肠道内 定植，并迅速增殖（尤其是母乳喂养儿）；出生 一周后双歧杆菌大量增殖；出生一个月左右婴儿 肠道菌群结构发生显著变化，3 月龄时双歧杆菌成 为婴儿肠道优势菌群^[8]。

而国内对婴儿早期肠道双歧杆菌定植和发 展的研究很少，检测的种类也局限于B. breve、 B. longum 等亚种^[9]，且双歧杆菌检测时间点不够 系统^{[9, 10]}。本研究通过对受试婴儿粪便中分离培养 到的双歧杆菌进行菌种水平的鉴定，首次对婴儿 早期肠道中双歧杆菌种群构造进行了全面系统的 分析。

本研究中，受试婴儿出生4 d 粪便开始有双 歧杆菌定植，且数量可达到6.0×10⁹ CFU/g 粪便， 定植率为8%。一周后定植率由8% 增至生后28 d 时的54%，至生后3 个月时达到60%，且双歧杆 菌数量维持在较高水平（1.0×10⁹~2.0×10¹¹ CFU/g 粪便）。但是婴儿个体之间双歧杆菌开始定植的 时间差异较大，且双歧杆菌定植不稳定，而且肠 道内已定植双歧杆菌的婴儿个体之间双歧杆菌数 量也存在较大差异。本研究中有3 名婴儿（包括 1 名顺产婴儿）至3 月龄时均未检出双歧杆菌，这 同Azad 等^[11] 的研究结果相似，个别婴儿4 个月时 粪便中仍未检出双歧杆菌，包括纯母乳喂养的顺 产婴儿。

大量研究已证明，双歧杆菌是肠道内微生物 里对人体健康有益的代表性菌群之一，维持及提 高双歧杆菌在人体肠道内的数量已被广泛认为是 促进人体健康的重要手段之一。近年来，人体肠 道双歧杆菌除了其数量以外，双歧杆菌的菌种构 成及其多样性对人体健康的影响同样受到关注。 研究表明，双歧杆菌的生理机能具有显著的菌种特异性，双歧杆菌的菌种构成及多样性上的差异 被发现是过敏症等疾患的病理学特征之一^[12]。本 研究中，首先出现在受试婴儿粪便中的肠道双歧 杆菌是B. bifidum，随着时间变化双歧杆菌的菌种 组成多样性明显增加。出生10 d 后，受试婴儿肠 道双歧杆菌由单一的B. bifidum 优势菌种发展为 B. catenulatum、B. breve、B. longum、B. dentium、 B. angulatum 以及B. infantis。本研究结果再度表 明B. bifidum 是研究受试婴儿早期最常分离到的双 歧杆菌优势菌种之一。

喂养方式是影响婴儿肠道菌群早期构建的重 要因素^[5]。已有研究表明和母乳喂养儿相比，人工 喂养儿双歧杆菌的定植时间延迟^[13]。本研究中婴 儿均为母乳喂养或者混合喂养，研究结果提示母 乳喂养婴儿双歧杆菌的定植可能比混合喂养儿早， 但至3 月龄时基本相平。因受试婴儿较少，特别 是本研究此时还没有纯人工喂养的婴儿参加，因 此还不能就喂养方式对婴儿双歧杆菌定植的影响 进行统计分析，将在后续研究中不断完善。

分娩方式是影响婴儿肠道菌群定植的重要因 素之一^[5]。和顺产婴儿相比，剖腹产婴儿肠道双歧 杆菌的数量较低，且双歧杆菌定植的种类更少^[14]； 剖腹产婴儿双歧杆菌定植延迟，双歧杆菌在1 月 时定植率才达到顺产水平^[15]。本研究中，因顺产 婴儿较少，还不能对顺产和剖腹产婴儿双歧杆菌 数量及种类进行统计分析，但考虑到受试婴儿多 数是剖腹产婴儿，因此推测剖腹产可能是造成受 试婴儿双歧杆菌定植延迟的因子之一，但仍需进 一步研究以证实。

Avershina 等^[16] 研究表明，婴儿出生10 d 内 的双歧杆菌是由B. longum 和B. breve 为优势菌种 的多菌种所组成。相比之下，本研究的受试婴儿肠 道双歧杆菌的早期多样性显著低于目前为止的研 究报道。考虑到本研究的受试对象多数是剖腹产 婴儿，推测剖腹产可能是造成肠道双歧杆菌早期 多样性减少的原因之一。但是，本研究的受试婴 儿数量整体偏少，今后还要继续观察。本研究结 果和Tsuji 等^[17] 的研究基本一致，即在3 个月时本 研究受试婴儿肠道双歧杆菌为肠道优势菌群，包括 B. longum、B. breve、B. infantis 和B. catenulatum。 B. breve、B. infantis 及B. longum 是婴儿肠道最常 见的双歧杆菌，而B. catenulatum、B. adolescentis 及B. longum 是成人粪便中最常分离到的双歧杆 菌^[18]。本研究受试婴儿肠道中B. infantis 出现较 晚，在3 个月时才在婴儿粪便中检测到高水平的 B. infantis，显著迟于其他报道^[19]。研究报告指出， 患过敏性疾病的婴儿肠道里会出现B. adolescentis 为代表的成人型双歧杆菌^[11]。本研究中，虽然未 检出B. adolescentis，但是婴儿肠道第10 天就开始 检出成人型双歧杆菌B. catenulatum，且之后检出 率也较高，这是否和剖腹产有关联，还需要进一 步研究。

本研究通过对婴儿肠道双歧杆菌进行连续全 面的追踪分析，发现受试婴儿早期肠道双歧杆菌 多样性偏低，婴儿型双歧杆菌出现偏迟，相反成 人型双歧杆菌发现较早。上述结果对发现婴儿肠 道双歧杆菌定植的特点和规律奠定了基础，有利 于进一步深入探讨双歧杆菌与婴儿健康的关系。