原发性肾病综合征（PNS）是儿童时期最常见 的肾小球疾病，其在儿童中的患病率约为10 万分 之16 ^[1]。肾上腺糖皮质激素是目前公认治疗PNS 的主要药物，根据正规足量激素治疗4 周反应， 将PNS 分为激素敏感型肾病综合征（SSNS）和激 素耐药型肾病综合征（SRNS）^[2]。大部分患儿对 激素治疗表现为敏感，但仍有部分患儿复发，其 中有45%~50% 的病人为频复发或激素依赖^[3]；约 20% 的患儿表现为激素耐药，其中约60%SRNS 患 儿发展为局灶性节段性肾小球硬化（FSGS），而 FSGS 患儿会逐渐演变为终末期肾病^[4]。SRNS 和 SSNS 在激素治疗前有相似的临床表现，没有特异 的实验室或者临床指标可以用来区分这两种分型， 肾活检虽对了解肾脏病理改变、预测激素反应性及 评估预后具有重要意义，但因其有创性，难以在儿 科临床工作中普及。近年来，国内外蛋白质组学 研究鉴定出多种SRNS 与SSNS 的差异性表达蛋白 质，如α1 抗胰蛋白酶（AAT）、转铁蛋白、结合 珠蛋白（HP）、细胞角蛋白9 等，提示这些差异 表达的蛋白质可能为预测SRNS 的生物标志物^[5]。 HP 和AAT 都属于急性期反应蛋白，在PNS 患儿 的病理生理过程中，HP 和AAT 可能会出现反应性 增高，本研究拟选取HP 和AAT 为研究指标，通 过检测血、尿中的HP、AAT 水平预测PNS 患儿对 激素治疗的反应。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2012 年9 月至2014 年1 月于本院诊断 并治疗的84 例PNS 患儿为研究对象，所有患儿均 为初发的PNS 患儿或停用糖皮质激素6 个月以上 的复发PNS 患儿，且临床诊断均符合2009 年中华 医学会儿科学分会肾脏病学组制订的《儿童常见 肾脏疾病诊治循证指南》标准^[6]；排除观察期间出 现严重感染、不能坚持正规激素治疗、使用过免 疫抑制剂及出现肾功能下降的患儿。经足量激素 治疗4 周后根据激素治疗反应将84 例PNS 患儿分 为SRNS 组（尿蛋白仍阳性）和SSNS 组（尿蛋白 转阴）。SSNS 组58 例，其中男43 例，女15 例， 年龄0.4~14 岁，平均年龄5±3 岁；SRNS 组26 例， 其中男18 例，女8 例，年龄1~13 岁，平均年龄 6±4 岁。另选取同期于本院体检中心体检的健康 儿童40 例为对照组，其中男29 例，女11 例，年 龄0.2~13 岁，平均年龄5±4 岁。本研究经医院伦 理委员会批准，受试者家属均知情同意。 1.2 标本收集与检测

所有患儿均于应用激素治疗前、治疗1 周及 4 周分别留取血、尿标本。采集PNS 患儿空腹静 脉血2 mL，静置60 min，3 000 rpm 离心5 min 分 离血清；在取血的同一日，留取新鲜晨起清洁中 段尿20 mL，4℃下以3 000 rpm 离心20 min，收集 上清液，血清及尿液均放置在-80℃超低温冰箱中 备用。因单次尿排泄量受到肾功能、尿量和尿液 浓缩情况等多种因素影响，故本研究采用尿肌酐 （Cr）排出量来校正单次尿HP、AAT 水平。收集 所有患儿的年龄、性别、体重、入院时病程等临 床指标；以及激素使用前的血胆固醇、血肌酐、 白蛋白、24 h 尿蛋白定量等生化指标。采用酶联 免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）测定血清、尿液中HP 和AAT 的浓度， ELISA 试剂盒由上海恒远生物科技有限公司提供。 1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件包对数据进行统计学 分析，正态分布计量资料采用均数± 标准差（x±s） 表示，两组间比较采用独立样本t 检验；非正态分 布计量资料使用中位数（四分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）] 表示，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验， 多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验，组间两 两比较采用 Nemenyi 秩和检验。计数资料采用例 数表示，两组间比较采用χ² 检验。采用受试者工 作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC 曲线）评价HP 和AAT 对激素治疗PNS 疗效 的预测价值。P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 PNS 患儿治疗前临床及生化指标分析

SSNS、SRNS 组患儿年龄、性别、体重以 及在入院时病程、血胆固醇、血肌酐、血白蛋 白、尿蛋白量之间比较差异均无统计学意义（均 P>0.05），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 SSNS 与SRNS 患儿治疗前临床及生化指标比较　[例或（x±s）]

表 1 SSNS 与SRNS 患儿治疗前临床及生化指标比较　[例或（x±s）]

SSNS 组与SRNS 组治疗前血清HP 水平均显 著高于对照组（P<0.05）；SRNS 组血清HP 水平 在治疗前、治疗1 周及治疗4 周时均较SSNS 组显 著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；但治疗前、 治疗1 周及治疗4 周时血清HP 水平分别在SSNS 及SRNS 组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。 见表 2。

表 2(Table 2)

表 2　各组不同时间血清HP 水平及尿HP/Cr 比值的比较　[P50（P25，P75）]

表 2　各组不同时间血清HP 水平及尿HP/Cr 比值的比较　[P50（P25，P75）]

SSNS 组及SRNS 组治疗前尿HP/Cr 比值均高 于对照组（P<0.05）；但在治疗前、治疗1 周及治 疗4 周时尿HP/Cr 比值在SSNS 及SRNS 组间比较 差异均无统计学意义（P>0.05）；且治疗前、治 疗1 周及治疗4 周时尿HP/Cr 比值分别在SSNS 及 SRNS 组内比较差异亦均无统计学意义（P>0.05）。 见表 2。 2.4 各组不同时间血清AAT 浓度比较

治疗前血清AAT 水平在对照组、SRNS 组和 SSNS 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在治 疗前、治疗1 周及治疗4 周时血清AAT 水平分别 在SRNS 和SSNS 组间及组内比较差异均无统计学 意义（P>0.05）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3　各组不同时间血清AAT 水平及尿AAT/Cr 比值的比较　[P50（P25，P75）]

表 3　各组不同时间血清AAT 水平及尿AAT/Cr 比值的比较　[P50（P25，P75）]

SSNS 组与SRNS 组治疗前尿AAT/Cr 比值均 显著高于对照组（P<0.05）；SRNS 组尿AAT/Cr 比值在治疗前、治疗1 周及治疗4 周时均较SSNS 组显著升高（P<0.05）；但治疗前、治疗1 周及治 疗4 周时尿AAT/Cr 比值分别在SSNS 及SRNS 组 内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 3。 2.6 血清HP 及尿AAT/Cr 比值的诊断价值

以SSNS 及SRNS 组血清HP 浓度做ROC 曲线 分析，结果显示曲线下面积（AUC）为0.904，当 血清HP 截点值为37.935 mg/mL 时，预测激素治疗 儿童PNS 疗效的效能最高，其敏感度为92.3%， 特异度为86.2%，Youden 指数为78.5%（图 1）； 以两组尿AAT/Cr 比值做ROC 曲线分析，结果显 示AUC 为0.899，当尿AAT/Cr 截点值为0.0696 时，预测效能最高，其敏感度为100%，特异度为 79.3%，Youden 指数79.3%（ 图 1）。以血清HP 浓度联合尿AAT/Cr 比值作ROC 曲线分析，结果 显示AUC 为0.971，敏感度为92.3%，特异度为 96.6%，Youden 指数88.9%，具有更好的预测效能 （图 2）。

图 1 血清HP 水平及尿AAT/Cr 比值预测激素治疗效果的ROC 曲线分析

图 2　血清HP 水平联合尿AAT/Cr 比值预测激素治疗效果的ROC 曲线分析

SRNS 患儿持续存在的尿蛋白，不仅使体内蛋 白质丢失；同时大量蛋白尿还作为一种独立的致 病因素，能诱导肾小管间质纤维化,加重肾脏病变。 迄今，尚缺乏早期诊断SRNS 的特异性生物标志物。 近年来，国内外蛋白质组学研究鉴定出多种SRNS 与SSNS 的差异性表达的蛋白质，如AAT、转铁蛋 白、HP、细胞角蛋白9 等^[5]。本研究选取HP 和 AAT 为研究对象，探讨其能否成为早期诊断SRNS 的生物标志物。本研究标本分别是取自于激素治 疗前以及激素治疗1 周、4 周，这样既可以避免药 物治疗干扰，又可以动态监测生物标志物与激素 治疗反应的关系。本研究提示血清HP 浓度和尿 AAT/Cr 比值在SRNS 组明显升高，同时应用ROC 曲线分析来评价其诊断SRNS 的效能。

HP 又称触珠蛋白,在炎症刺激如感染、自身 免疫反应等时，血清中HP 水平会升高^[7]。HP 主 要由肝脏合成，在脂肪组织、皮肤、肺、肾脏也 有低度表达。HP 在参与宿主抗感染及损伤组织的 修复中起着重要的作用，还对淋巴细胞功能有抑 制作用，能调节Th1/Th2 平衡^[8]。HP 表达的改变 很可能是局部炎症后急性相蛋白的反应性变化以 及免疫作用。免疫失衡，比如T 细胞功能紊乱， 2 型细胞因子上调，都可以导致微小病变型肾病综 合征和局灶节段性肾小球硬化，而免疫失衡就可 以引起血清HP 升高。据报道，在肾小球疾病如肾 小球肾炎、膜性肾病、IgA 肾病中，血清HP 水平 明显升高^[9]。推测免疫因素导致SRNS 和SSNS 不 同的病理生理过程，SRNS 较SSNS 患儿血清HP 明显升高。在本研究中PNS 患者尿HP 水平比对 照组明显升高，但是在SRNS 和SSNS 之间没有发 现差异，有研究表明糖尿病肾病患者早期肾功能 下降时尿中HP 增加，考虑与肾小球通透性增加， 使血清中的HP 漏入尿液以及肾小管损伤有关^[10]， 本研究所有研究对象肾功能均正常，考虑在肾功 能正常时SSNS 和SRNS 具有相似的尿HP 排泄^[9]， 因此，仅血清HP 升高提示PNS 患儿激素耐药可能， 而尿HP 不适用于做预测SRNS 的生物标志物，且 当血清HP 高于37.935 mg/mL 时，提示可能激素 耐药（AUC 为0.904，敏感度为92.3%，特异度为 86.2%）。

AAT 亦是一种急性时相炎症反应蛋白，是人 类血浆中最丰富的蛋白酶抑制剂，主要由肝细胞 分泌，肝外组织如肠、肾、脾等也能产生少量的 AAT ^[11]。Hidvegi 等^[12] 发现在细胞内反应途径中， z 变异的AAT 能够活化NF-κB，NF-κB 广泛存在于 人体各种组织细胞中，包括免疫细胞、肾小球系 膜细胞及肾小管上皮细胞等，许多诱导剂能使培 养的肾细胞中NF-κB 激活，调节多种促炎因子的 转录。本研究中发现肾病综合征患者尿AAT/Cr 比 值明显升高，SRNS 患者升高尤为显著，目前原因 尚不明确。文献报道血清和尿的蛋白组学分析表 明蛋白水解活性增加，发现大量的白蛋白和AAT 片段，考虑在对于非特异性刺激物应答过程中， 由血多形性有核白细胞引起的氧化应激，并激发 足细胞结构改变^[13]。也有研究表明AAT 通过发挥 其抑制中性粒细胞抗炎、抗凋亡作用，在肾小管 损伤后，肾小管上皮细胞反应性的表达AAT^[14]， Carlson 等^[15] 和Liew^[16] 均报道用免疫组化方法在 肾小管上皮细胞检测到AAT。国内的研究从蛋白 质和mRNA 水平证实了肾小管上皮细胞可表达 AAT，肾小管上皮细胞表达AAT 的意义是否与肾 病综合征激素耐药相关仍为研究热点问题^[17]。本 研究提示尿AAT/Cr 比值可能成为预测SRNS 的生 物标志物，当尿AAT/Cr 比值大于0.0696 时，提示 可能激素耐药（AUC 为0.899，敏感度为100%， 特异度为79.3%），本研究血清AAT 的浓度在三 组之间没有差异，推测大量蛋白尿等损伤因素引 起足细胞改变以及肾小管损伤，氧化应激反应主 要发生在肾小管及肾小球，而不是血液系统，故 血清中AAT 无明显升高。

总之，血清HP 浓度及尿AAT/Cr 比值升高在 PNS 患儿发病初期提示可能激素耐药，其可用来 预测激素的疗效。推测血清HP 浓度及尿AAT/Cr 比值升高与免疫因素及肾小球、肾小管损伤有关。 SRNS 血清和尿液中的生物标志物，可能为SRNS 患儿耐药机制在蛋白质水平的反应产物，联合检 测上述两种生物标志物预测效能更佳（AUC 为 0.971，敏感度为92.3%，特异度为96.6%），但上 述研究成果有待进行大规模、多中心队列研究， 从分子机制进一步证明血清HP 和尿AAT/Cr 比值 作为激素耐药的生物学标志物的可行性。