儿童原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome,PNS）是一种常见的儿科肾脏疾病，是 由于多种病因造成肾小球基底膜通透性增高，大 量蛋白从尿中丢失的临床综合征，发病机制至今 仍未阐明，环境、遗传、治疗等因素可影响其病 变的进展和预后。近年来研究发现，肾素- 血管 紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）在肾 脏疾病的发生发展中发挥重要作用^{[1, 2]}，血管紧张 素- Ⅱ（angiotensin Ⅱ ,Ang Ⅱ） 是RAS 主要效 应激素，不仅参与调节肾小球内血液动力学的变 化，还可引起肾小球系膜细胞增生和细胞外基质 增多，而这些均是导致肾小球硬化的关键因素。 Ang Ⅱ主要由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶 （angiotensin-converting enzyme,ACE） 作用下生成。 血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）是新近发现的活性酶^[3]，是RAS 新成员， 能水解Ang Ⅱ成为血管紧张素1~7（Ang-1~7）， 是肾脏重要的保护因子。已有研究发现，ACE 基 因、Ang Ⅱ -1 型受体基因等RAS 相关基因多态性 与儿童PNS 的发病及预后有关^[4]，然而有关ACE2 基因多态性与儿童PNS 的关系未见报道。本研究 采用聚合酶链反应- 限制性核酸内切酶片段长度 多态性技术分析ACE2 基因A9570G 多态性，探讨 ACE2 基因多态性与儿童PNS 的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选择2012 年6 月至2014 年3 月45 例在广 州市第一人民医院和21 例在广州市南沙中心医 院住院的PNS 患儿共66 例，所有患儿均为广东 汉族，彼此间无血缘关系。其中男39 例，女27 例； 年龄3~14 岁，平均年龄7.8±3.2 岁； 身高 113±18 cm； 体重30±11 kg； 体重指数18±3； 发病时间7~35 d，平均病程22±9 d；24 h 尿蛋 白4.3±2.1 g；血浆白蛋白19±5 g/L；血浆胆固醇 7.2±1.5 mmol/L。其中40 例表现为单纯型，26 例 表现为肾炎型。

PNS 的诊断及糖皮质激素治疗反应类型依据 中华医学会儿科学分会肾脏病学组2009 年指南判 断^[5]。PNS 诊断标准：（1）大量蛋白尿；（2）低 蛋白血症，血浆白蛋白低于25 g/L；（3） 高脂血 症，血浆胆固醇高于5.7 mmol/L；（4）出现不同 程度的水肿。激素敏感的判定：泼尼松足量治疗4 周内尿蛋白阴转；激素耐药的判定：泼尼松足量 治疗4 周以上尿蛋白仍阳性。

入选标准：符合PNS 诊断，且无糖皮质激素 禁忌症，无肾功能衰竭、血栓及严重感染等并发症， 入院前未经糖皮质激素治疗，确诊后糖皮质激素 规范治疗时间不少于4 周。

对照组来源于同时期上述两家医院健康体检 的儿童各30 例，共60 例，其中男32 例，女28 例，年龄4~14 岁，平均年龄 8.2±2.4 岁，身高 117±18 cm，体重30±11 kg，体重指数18±4 。 两组性别构成、年龄、身高、体重、体重指数比 较差异无统计学意义（P>0.05）。 1.2 样本采集和DNA 提取

所有患儿空腹抽取静脉血5 mL 置于EDTA 抗 凝试管中，采用Tiangen 公司提供的外周血基因组 DNA 提取试剂盒提取DNA，标化DNA 浓度值至 20 mg/L，溶于TE 缓冲液中，-80℃冻存。 1.3 ACE2 基因多态性检测

采用聚合酶链反应- 限制性核酸内切酶片段 长度多态性技术进行基因分型。上游引物序列为： 5'-CATGTGGTCAAAAGGATATCT -3'，下游引物序 列为：5'-AAAGTAAGGTTGGCAGACAT-3'。酶切反 应体系20 μL，包括特异性PCR 扩增产物8 μL， Alu Ⅰ 酶1 U，10×buffer（Alu Ⅰ 酶自带）2 μL， 消毒双蒸水9 μL。酶切温度：37℃，酶切时间： 16 h。酶切产物点样于2% 琼脂糖凝胶，以50 bp ladder 标志作为判断DNA 片段大小的标准物， 100 V 电泳35 min，在紫外灯下观察电泳条带以鉴 定基因型。抽取部分样品测序核实基因型。 1.4 统计学分析

由于ACE2 基因位于X 染色体，按性别进行 分类统计。采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分 析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，计 数资料用构成比（%）表示。两组间均数比较采 用成组t 检验，组间计数资料比较采用χ² 检验。 P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 ACE2 基因型测序及酶切电泳结果

基因测序（图 1）证实ACE2 基因 A9570G 多 态性位于第3 内含子第4 碱基，纯合子呈单峰，杂合子呈双峰。AA 基因型的PCR 产物被酶切成 281 bp 和185 bp 两个片段，GG 基因型的产物不能 被酶切，电泳时仅有1 个片段，长度为466 bp， 而AG 杂合子表现为同时具有281 bp、185 bp 和 466 bp 3 个条带（图 2）。

图 1 ACE2 基因A9570G 多态测序图图中箭头所 指部分为多态性位点，纯合子呈单峰，杂合子呈双峰。

图 2　酶切电泳条带

在女性，PNS 组和对照组均以AA 基因型 最常见，两组基因型分布差异无统计学意义 （P=0.689）；两组等位基因频率比较差异也无统 计学意义（P=0.621），见表 1。在男性，对照组 和肾病组均以A 基因型常见，两组等位基因频率/ 基因型分布比较差异也无统计学意义（P=0.715）， 见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 PNS 组和对照组间ACE2 基因型分布和等位基因频率的比较　[n（%）]

表 1 PNS 组和对照组间ACE2 基因型分布和等位基因频率的比较　[n（%）]

将66 例PNS 患儿按糖皮质激素治疗反应分为 激素敏感组和激素耐药组进行亚组分析。在女性， 激素敏感组GG 基因型频率低于激素耐药组，差 异有统计学意义（P=0.018）；激素敏感组G 等位 基因频率亦低于激素耐药组，差异有统计学意义 （P=0.023），见表 2。在男性，激素敏感组G 基 因型/G 等位基因频率低于激素耐药组，差异有统 计学意义（P=0.017），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2　PNS 亚组间ACE2 基因型分布和等位基因频率的比较　[n（%）]

表 2　PNS 亚组间ACE2 基因型分布和等位基因频率的比较　[n（%）]

ACE2 是一种1 型跨膜糖蛋白，与ACE 具有 一定序列相似性的羧肽酶，在肾脏、血管内皮、心、 肺等多种器官和组织中均有表达。ACE2 的主要底 物为Ang Ⅱ，可将其分解为Ang-1~7，后者与其特 异受体Mas 结合，形成ACE2-Ang-（1~7）-Mas 通路， 发挥与传统ACE-Ang Ⅱ -AT1 通路相拮抗的作用。 ACE2 作为RAS 新发现的关键酶，近年来迅速成 为研究热点。Shiota 等^[6] 用链脲佐菌素诱导ACE2 基因敲除小鼠和野生型小鼠发生糖尿病，分别在 第4 周和第18 周检测它们的尿液，发现ACE2 基 因敲除小鼠较野生型小鼠的蛋白尿出现早、进展 快；ACE2 基因敲除小鼠的肾小管间质损害更为严 重。Nadarajah 等^[7] 发现，足细胞ACE2 表达对肾 损伤具有明显的保护作用，可见ACE2 对肾小球和 肾间质具有保护作用。徐志泉等^[8] 研究发现，肾 病综合征患儿存在RAS 的激活，ACE2 可能参与 肾病综合征的发病。

ACE2 基因定位于Xp22^[9]，有18 个外显子， 本研究中的SNP 位点A9570G 位于第3 内含子， 紧靠外显子的位置，这个位点的变异可以改变 mRNA 的剪接^[10]，其改变可能对基因的功能产生 影响，从而参与疾病的发生发展。ACE2 基因多态 性与高血压、冠心病等疾病的关系已被多个研究 证实^{[11, 12]}，与肾脏疾病的关系也越来越受重视， Chaoxin 等^[13] 研究发现携带G 等位基因的男性糖 尿病患者容易出现尿蛋白，提示G 等位基因可能 是肾脏损害的易感因素之一，而Currie 等^[14] 针对 糖尿病肾病与ACE2 基因多态性的关系的研究，并 未发现阳性结果。有关ACE2 基因多态性与肾脏疾 病的研究结果尚不一致，有待进一步研究。本研 究发现，ACE2 基因A9570G 多态性在PNS 患儿和 健康儿童中的基因型分布和等位基因频率未见明 显差异，提示该多态性位点与儿童PNS 的发病无 明显关系。进一步行亚组分析发现，在女性，激 素敏感组GG 基因型频率和G 等位基因频率均低 于激素耐药组；在男性，激素敏感组G 基因型/G 等位基因频率低于激素耐药组，提示ACE2 基因 A9570G 多态性与PNS 患儿激素治疗反应有关，G 等位基因可能是激素耐药的遗传易感因素，而糖 皮质激素是治疗儿童PNS 的首选药，因此，检测 ACE2 基因A9570G 多态性有助于儿童PNS 的疗效 评估及预后判断。ACE2 基因A9570G 多态性如何 影响儿童PNS 对激素治疗的反应目前尚不清楚。 有研究发现，用牛血清白蛋白处理人肾近曲小管 上皮细胞可以导致ACE m-RNA 及蛋白水平显著升 高，ACE2 m-RNA 与蛋白水平下降，而细胞培养 液中Ang Ⅱ生成量增多，说明在病理状条件下产 生蛋白尿后，可能通过上调肾脏ACE 水平，下调 ACE2 水平诱导局部RAS 激活，加速肾脏病变进 程^[15]。因此，本研究推测，当儿童PNS 发生后大 量的蛋白尿导致局部RAS 激活，由于基因多态性 的存在导致患儿局部RAS 激活的程度和反应有所 不同，特别是局部ACE2 水平的降低，导致肾脏病 变程度和对药物治疗反应均有所不同。

综上所述，本研究通过对PNS 患儿ACE2 基 因 A9570 多态性分析，发现ACE2 基因 A9570 多 态性与儿童PNS 的发生无明确关联，但可能与 PNS 患儿糖皮质激素治疗反应有关，G 等位基因有 望作为PNS 患儿预后的预测指标。但本研究样本 量小，尚需大样本、多中心进一步研究，并深入 探讨其内在机制，为儿童PNS 防治提供有效的理 论依据。