传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis,IM）是儿童时期常见的感染性疾病之一，是由 EB 病毒感染所致的单核 - 巨嗜细胞系统传染性疾病。其临床表现复杂多样，且首发症状不一，故临床易漏诊、误诊^[1]，若治疗不及时可引起上呼吸道梗阻、脑炎、多发性神经炎、心律失常、心肌炎、肝功能衰竭及自身免疫性溶血等严重的并发症，危及患儿的生命。

IM 的临床诊断主要依赖于病毒学检测，然而EB 病毒的培养周期长，技术复杂，费用昂贵，且EB 病毒DNA 的检测，只有在病毒血症时才能检出，对于发病早期、轻症及幼儿易造成漏诊^[2]。如能在发病早期通过取材方便的外周血检测就能检测到出现早、特异性强、灵敏度高的分子标志物，这对儿童IM 的早期诊断和治疗具有重要的临床价值。IM 系 EB 病毒感染所致，EB 病毒具有典型的嗜 B 淋巴细胞特性，感染后主要侵犯血液系统及淋巴免疫系统^[3]。这提示如果对该病进行血浆比较蛋白质组学分析，有望能找到针对 EB 病毒感染所致 IM 相关的出现早、特异性强、灵敏度高的分子标志物，协助临床诊断。本研究采用蛋白质组学的研究方法，通过双向凝胶电泳、质谱分析等生物信息学技术方法，获得 IM 患儿及同龄正常儿童的血浆蛋白质图谱，通过对这些图谱进行相互的差异分析并结合 INTERNET 数据库资料，力图找到 IM 特异表达或异常表达的血浆分子标志物，为儿童 IM 的早期诊断和治疗提供临床参考价值。1　资料与方法1.1　研究对象

2013 年 10~12 月在泸州医学院附属中医院儿科住院的典型的 IM 患儿 10 例为研究对象，发病年龄 2 岁 4 个月至 6 岁，平均年龄 4.5 岁，男女各 5 例。10 例患儿均符合 IM 诊断标准^[4]：（1）临床表现有发热、咽峡炎、淋巴结及肝脾肿大；（2）辅助检查：血常规检查示变异淋巴细胞 >10％，特异性血清学检查呈阳性，EBV-VCA-IgM 及 IgG 抗体效价增高，血嗜异凝集反应阳性。6 例健康同龄儿童作为对照组。两组儿童家属对本研究均知情同意。1.2　主要试剂和仪器设备

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等所有双向电泳试剂及固相 pH 梯度凝胶（pH 4~7，17 cm）均购自 Bio-Rad 公司；蛋白分子量 marker 和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自碧云天生物技术研究所；其他常 规 试 剂 均 购 自 GE Healthcare 公 司。ChemiDoc XRS 蛋白凝胶成像系统及双向电泳系统购自 BioRad 公司；高速冷冻离心机购自 Sigma 公司。分析软件及统计处理软件包括 ImageMaster 2D Platinum V5.0、SWISS-PROT 蛋白数据库、Mascot 肽指纹图谱检索匹配软件及 SPSS 13.0 统计软件等。1.3　血浆样品的收集

抽取 10 例 IM 患儿及 6 例同龄健康儿童清晨空腹静脉血2 mL 于医用血常规管中（EDTA 抗凝），立即置 4℃冰箱静置 30 min 后普通离心机离心（3 000 g×10 min），吸取上清液（血浆蛋白）分装并冻存于超低温冰箱 -80℃备用。1.4　血浆蛋白双向电泳（2-DE）分离

实验时取出以上所有冻存血浆，置 4℃冰箱解冻 30 min 后离心（15 000 g、4℃ 1 h），以去除血浆中将干扰双向凝胶电泳的核酸、脂类、多糖及部分大分子蛋白质^[5]。各样本取离心后血浆上清液 3 μL 进行血浆蛋白双向电泳分离^[7]。最后用银染色法进行染色获得各样本的血浆 2-DE 图谱。各样本重复双向电泳 3 次，每组至少获得 15 个重复性较好的双向凝胶电泳图谱以供下一步分析。1.5　凝胶成像及 2-DE 图谱分析

将所有银染后的凝胶置 ChemiDoc XRS 蛋白凝胶成像仪中照相成像，然后采用 Image Master 2D Platinum V5.0 双向电泳图谱软件（Amersham Biosciences,Placataway,NJ,USA）软件对所有双向电泳图谱进行组内、组间蛋白质表达的差异分析，筛选出双向电泳图谱中标准化总灰度值（%vol）平均相差 2 倍及以上的蛋白点为差异表达蛋白。双向电泳图谱的斑点识别、半定量检测、配对分析及差异蛋白点的鉴别标准方法同文献^[6]。选取差异表达明显、分辨较清楚的蛋白点送北京肿瘤防治研究所质谱鉴定分析。最后将质谱分析结果结合 SWISS-PROT 数据库的搜索及 2-DE 图谱上相应点的表观分子量、等电点等进行综合分析来确定各差异表达蛋白点。1.6　统计学分析

采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理与分析，计量数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，两组间均值的比较采用成组t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。2　结果

2.1　血浆蛋白 2-DE 凝胶图谱及质谱分析结果

血浆样本总蛋白 2-DE 图谱可见大多数蛋白点分布在分子量 Mw30~70 kD 和等电点 pI 5~6.5 范围内，同一样本的 2-DE 图谱蛋白点在对应位置上有较好的重复性，不同图谱间蛋白点在 Mw 和 pI 方向上有一定偏差，但并不影响结果的分析。2.2　蛋白质表达的差异分析

经 Image Master 2D Platinum V5.0 软件进行比对分析，发现 8 个蛋白质点存在明显差异变化，其中蛋白点 1、2、3、4、5、8 均较对照组降低，而蛋白点 6、7 较对照组升高（图 1~2）。

图 1　IM 组与对照组对应蛋白点的 2-DE 图谱的比较 蛋白点 1、2、3、4、5、8 表达均较对照组降低，蛋白点 6、7表达均较对照组升高。

图 2　两组各差异蛋白点 2-DE 图谱灰度值比较 与对照组比较，a 示P<0.01，b 示P<0.05。

选取以上差异表达明显且分辨较清楚的 8 个蛋白点作进一步基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析，结合 SWISS-PROT 数据库的搜索及 2-DE 图谱上相应点的表观分子量、等电点等进行综合分析，最终共获得 7 个蛋白质（蛋白点 6、7 鉴定为同一蛋白质）：血色素结合蛋白（hemopexin,Hpx）、VitD3 结 合 蛋 白（vitamin D binding protein,DBP）、胎球蛋白 A （fetuin A）、C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、载脂蛋白A（apolipoprotein A,ApoA )、结合珠蛋白（haptoglobin,HPT）、甲状腺运载蛋白（transthyretin,TTR），它们的功能大多与机体的炎症反应或肝脏的分泌功能相关（表 1）。其中，除 HPT（蛋白点 6、7）表达量较对照组明显升高外，其余蛋白（蛋白点 1、2、3、4、5、8）的表达量均较对照组明显降低（图 2）。

表 1(Table 1)

表 1 　差异蛋白点质谱分析信息

表 1 　差异蛋白点质谱分析信息

Hpx 是一种由肝细胞合成的急性时相蛋白，对 T 细胞介导的炎症反应具有负调节作用^[7]；临床研究发现，在严重脓毒症感染等疾病中血液中的 Hpx 浓度会明显下降，这使得 Hpx 浓度的测量可作为感染标志的生物标志物^[8,9]。DBP，主要在肝脏中合成，在血液中主要与 VitD3 结合成结合型VitD 在血中运输，还参与机体的免疫调节及炎症反应^[10]。Fetuin A 也是由肝细胞合成分泌的，研究发现在各种损伤和炎症性疾病中其血清浓度很低，被认为是一种负性的急性反应蛋白^[11]。CRP 是由肝脏合成的急性时相反应蛋白，在许多炎性疾病、免疫性疾病中其血浆浓度急剧升高^[12]，然而本研究发现 CRP 在 IM 组血浆中含量明显下降，不过这与 van de Veerdonk 等^[13] 研究小组研究的 EB 病毒急性感染结果一致。可见，血浆 CRP 浓度减低有可能是 IM 患儿的一个标志性生物分子。ApoA-1是肝细胞合成的一种载脂蛋白，当肝脏病理炎症活动度越严重，ApoA-1 降低越明显。有文献报道，血清 ApoA-1 水平与肝脏严重程度密切相关，能可靠地反映肝细胞损害的程度，比血清胆固醇、甘油三酯更敏感^[14]。TTR 是 55 kDa 的同源四聚体蛋白，在血中主要运载甲状腺激素。在肝脏疾病、营养不良和急性炎症时，TTR 在血清中的表达量会降低^[15]。由此可见，以上在 IM 患儿组血浆含量明显下降的这些蛋白均主要在肝脏合成，且以上很多研究证实以上蛋白大都在肝功能损伤时表现为明显下降，这充分说明 IM 患儿多伴有不同程度的肝功能损伤。

此外，本研究发现在 IM 组血浆含量明显升高的蛋白— HPT 也主要由肝细胞合成。HPT 是一种具有免疫调节特性的血红蛋白结合蛋白，也是一种急性时相蛋白，在慢性肝病，如肝纤维化、肝硬化中其血浆含量明显降低^[16]，但在肝脏的急性损伤中，HPT 却明显升高，在肝损伤的急性反应期作为积极保护作用的抗氧化剂以预防肝损伤^[17]。以上在 IM 组血浆含量明显降低的蛋白提示，IM患儿伴有明显的肝功能损伤，再结合 HPT 的升高现象，综合提示 IM 患儿伴有的肝功能损伤处于损伤急性期。

IM 是一种由 EB 病毒感染引起的全身免疫异常的疾病，容易发生免疫功能紊乱，出现肝脏功能受损^[18]，这一结论支持该研究结果。由此可见，通过比较蛋白质组学分析获得的 IM 患儿血浆差异表达蛋白，能够为 IM 的临床诊断和治疗提供一定的参考价值。若对本研究获得的 7 个明显差异表达血浆蛋白做进一步分析，特别是对减低的 CRP与升高的 HPT 进行联合分析，可望能够找到为儿童 IM 的早期诊断和治疗提供一定参考价值的血浆特异性标志物，以减少临床误诊及漏诊现象。同时提示：只要疾病确诊，在进行抗病毒、对症治疗过程中，一定要尽早进行保肝护肝治疗。