再生障碍性贫血（aplastic anemia，简称再障）是由免疫机制介导为主的、多因素综合作用引起的骨髓造血功能衰竭、全血细胞减少为特征的血液系统疾病，已研究证实调节性 T 细胞（Treg）表达紊乱参与了再障的发病及转归^[1]，而转录因子Foxp3 及活化的 T 细胞核因子（NFAT）在 Treg 的发育和分型中起重要作用，Foxp3 可能通过翻译水平来改变 Treg 的抑制功能，Foxp3 与 NFAT1 之间相互依存，两者在自身免疫性疾病中的作用逐渐成为研究热点，但有关 Foxp3 与 NFAT1 在再障发病中的作用目前尚不清楚，且两者联合检测在国内外尚较少。本研究采用免疫印迹试验（Western blot）方法检测再障患儿外周血中 Foxp3 及 NFAT1在蛋白水平的表达，并分析其与外周血血红蛋白（Hb）、白细胞（WBC）及血小板（PLT）数量的相关性，探讨它们之间的相互关系及在再障免疫学发病机制中的作用。1　资料与方法1.1　研究对象

研究对象为郑州市妇幼保健院、郑州大学一附院及三附院 2012 年 6 月至 2013 年 12 月确诊并治疗有效达缓解标准的 68 例再障患儿，其中男33 例，女 35 例，年龄 2~13 岁，中位年龄 7 岁；诊断及疗效标准均符合《小儿再障诊疗建议》^[2]。均为初治患儿，既往均未给予输血及免疫抑制剂治疗。入院后均给予免疫抑制剂、小剂量皮质激素、雄性激素及预防出血、贫血及感染等一般对症支持治疗，治疗 6 个月后均达缓解标准（恢复期）。郑州市妇幼保健院同期体检的 60 例健康儿童作为对照组，其中男 30 例，女 30 例，年龄 1~13 岁，中位年龄 6 岁，其体检各项指标均在正常范围内。对照组与再障组年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05）。该研究获得两组儿童家长知情同意。1.2　标本的采集

对照组于清晨空腹抽取外周静脉血 5 mL，再障组于发病期及治疗 6 个月达恢复期清晨空腹抽取外周静脉血 5 mL，用 EDTA 抗凝，其中 1 mL用于检测外周血Hb、WBC及PLT数量，其余4 mL 采用密度梯度离心法分离单个核细胞，保存于 -80℃冰箱，用于 Western blot 检测。1.3　Foxp3和NFAT1蛋白的检测

采 用 Western blot 法 检 测 Foxp3 和 NFAT1 蛋白的表达。提取细胞样品的蛋白质，采用 BCA 法测定蛋白质含量，将提取好的蛋白质样品在 BioRad 电泳槽中进行电泳，Foxp3 蛋白采用半干转膜法、NFAT1 蛋白采用不连续转膜法分别进行转膜，用封闭液封闭后洗膜 3 次，一抗鼠抗人 NFAT1 蛋白单克隆抗体（1 : 100 稀释）、一抗兔抗人 Foxp3蛋白多克隆抗体（1 : 200 稀释）、一抗鼠抗人β-actin蛋白单克隆抗体（1 : 1 000 稀释）分别于4℃摇床孵育至少 12 h，PBST 洗膜 3 次，用 HRP 标记的山羊抗鼠及山羊抗兔 IgG 抗体（稀释比例均为1 : 10 000），室温摇床孵育 1 h，PBST 洗膜 3 次，用 ECL 化学发光试剂作用后于暗室内压 X 光片曝光、显影、定影，水洗胶片晾干后保存。1.4　统计学分析

采用 SPSS 15.0 统计软件进行数据处理与分析，计量数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用 LSD 法，变量间的相关性分析采用 Pearson 积矩相关分析法，P<0.05 为差异有统计学意义。2　结果2.1　再障组与对照组外周血 Foxp3 及 NFAT1 表达的比较

再障组发病期患儿外周血中 Foxp3、NFAT1蛋白的表达水平较对照组明显降低（P<0.05）；再障组恢复期的表达水平较发病期明显升高（P<0.05），与对照组比较差异无统计学意义（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 两组中Foxp3 及NFAT1 蛋白的表达水平比较（x±s）

表 1 两组中Foxp3 及NFAT1 蛋白的表达水平比较（x±s）

再障组发病期患儿外周血中 Foxp3 和 NFAT1蛋白的表达呈正相关性（r=0.812，P<0.05）（图 1）。

图 1　IM 再障组发病期患儿外周血中Foxp3和NFAT1蛋白表达的相关性

再障组恢复期患儿 Foxp3 蛋白表达水平与外周血 Hb、WBC 及 PLT 数量均呈正相关关系（r分别 为 0.537、0.579、0.655；P<0.05）；NFAT1 蛋白表达水平与外周血 Hb、WBC 及 PLT 数量亦均呈正相关关系（r分 别 为 0.497、0.524、0.623；P<0.05）。3　讨论

细胞免疫异常在再障的发病中起主导作用。新近研究证明，再障患者外周血中存在 Treg 数量和功能的异常^[3,4]，而Foxp3 特异性地表达在CD4^{+ CD25+Treg 中，参与了 Treg 的发育、分化及免疫抑制功能[5]。研究发现，Foxp3 基因缺陷的小鼠体内CD4+ CD25+Treg 数量减少或调节功能缺失，可诱发严重的自身免疫性疾病，因此 Foxp3 对机体免疫稳态的调节起决定性作用[6]。Foxp3 的蛋白表达水平在 T 细胞抗原受体（TCR）刺激后有所上升，且上升幅度与 Treg 的抑制功能呈明显正相关，提示 Foxp3 可能通过翻译水平来改变 Treg 的抑制功能[7]。NFAT 是 TCR 介导的信号转导通路中非常关键的转录因子，可与人 IL-2 启动子的末梢抗原受体应答元件结合，并能产生快速诱导作用的核因子[8]。Solomou 等[3] 研究证实，再障患儿外周血中 Treg 表达水平降低，Foxp3 在蛋白水平和 mRNA水平均明显降低，同时 NFAT1 蛋白的表达亦降低，且 NFAT1 蛋白的低表达可能可以解释 Treg 的减少频率和 Foxp3 的低表达，提示 Treg 缺乏及 Foxp3、NFAT1 表达降低与再障的发病有关。}

本研究用 Western blot 方法检测 68 例再障患儿治疗前后及 60 例健康儿童的外周血中 Foxp3、NFAT1 蛋白的表达水平的变化，发现再障患儿发病期（治疗前）较对照组明显降低，与 Solomou等^[3] 研究结果一致，提示再障患儿体内 Foxp3 与NFAT1 蛋白在外周血中表达是降低的，且发病期表达低于恢复期，由此可能导致了机体免疫耐受被打破，并启动自身免疫应答，促进了再障的发生，提示 Foxp3 与 NFAT1 蛋白的低表达可能参与了再障的发病。经治疗有效后外周血中 Foxp3 与NFAT1 蛋白的表达水平上升，且与外周血 Hb、WBC 及 PLT 数量均呈正相关性，说明经免疫调节剂治疗有效后，机体免疫功能恢复，随之血象也逐渐恢复正常。因此，本研究认为 Foxp3 与NFAT1 蛋白在一定程度上可以提示病情的变化。转 录 因 子 Foxp3 及 NFAT 均 在 Treg 的 发 育和分型中起重要的作用。Bettelli 等^[9] 研究发现：Foxp3 通过抑制 NFAT 的活性发挥它强有力的免疫抑制作用，它们之间相互联系，并且 Foxp3 可以阻断 NFAT 调控的基因表达。NFAT 蛋白的一部分片段定位于 Treg 的核心，在此处选择性地与Foxp3 蛋白结合，从而控制 Treg 的抑制功能^[10]。当 NFAT 家族成员缺失时，CD4 T 细胞向 Treg 转化的能力也会明显降低，NFAT 的数量也决定了TGF-β 诱导的 Treg 的表达量^[11]。本研究显示，再障患儿外周血单个核细胞内 Foxp3、NFAT1 蛋白的表达呈正相关性，说明两者在 Treg 的发育和分化中可能起协同作用。

综上所述，本研究表明，再障患儿外周血单个核细胞中 Foxp3、NFAT1 蛋白表达明显降低，两者的表达水平呈正相关性，且与外周血 Hb、WBC及 PLT 数量均呈正相关性，提示 Foxp3、NFAT1蛋白的低表达可能参与了再障的发生发展，而且在一定程度上可以提示病情的变化，此发现可作为再障免疫治疗的新靶点之一进行深入研究。