新生儿（特别是早产儿）因呼吸系统疾病常 需要长时间吸入高浓度和/ 或高压力氧气，幸存者 常常发生肺部氧化应激损伤，遗留明显的肺发育 障碍和肺功能衰竭，严重影响患儿生活质量^[1]。 研究表明，高氧性肺损伤的机理与氧化应激、细 胞因子、一氧化氮、中性粒细胞的过度活化及肺 泡表面活性物质变化等多种因素密切相关^{[2, 3, 4]}。活 性氧簇（reactive oxgen species,ROS）常通过还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide,NADPH）或线粒体途径产生^[5]。关于 PKCβ/P66Shc 是否参与高氧环境下肺泡上皮细胞线 粒体内ROS 的产生，国内外尚无文献报道。本实 验从发生凋亡的氧化应激信号通路（线粒体前途 径）来阐明高氧性肺损伤的机制，从而为减轻高 氧肺损伤寻找新的治疗靶点。

研究显示，在高氧环境下线粒体发生氧化应 激反应，产生大量ROS^{[6, 7, 8]}，而ROS 是凋亡发生的 上游因子，可触发细胞的凋亡发生^[8]。P66Shc 是 哺乳动物生命周期相关蛋白，主要功能是调节细 胞氧化应激反应和调控生命周期，是近年来研究 细胞氧化应激的关键蛋白^[9]。主要定位于细胞浆， 正常情况下处于失活状态，不影响线粒体功能。 本课题组的前期研究结果表明，在高氧刺激下， 首先活化 PKCβ，使胞浆内的 P66Shc 发生磷酸化， 进而被脯氨酰异构酶（Pin 1）识别发生异构化（Pin 1 介导P66Shc 的线粒体转位），在蛋白磷酸酶2A （protein phos phatase 2A,PP2A）的作用下去磷酸 化进入线粒体，活化的P66Shc 转移到线粒体呼吸 链酶复合体Ⅲ氧化细胞色素C 产生ROS/H₂O₂ ^{[10, 11]}。 可见PKCβ/P66Shc 是调节细胞氧化应激反应重要 的信号通路。本课题组的前期研究已经建立了高 氧诱导人肺泡Ⅱ型细胞（A549）损伤模型^[10]，已 证实了mitoKATP 通道开放剂二氮嗪具有降低Omi/ HtrA2 表达和A549 细胞凋亡率，从而减轻高氧诱 导的肺损伤的作用^[12]。并且已经证明高氧诱导肺 泡上皮细胞损伤的过程中，PKCβ/P66Shc 氧化应 激通路介导了细胞的凋亡的过程^[10]。本研究将在 此基础上进一步探讨高氧诱导线粒体产生ROS 的 机制是否与PKCβ/P66Shc 途径有关，LY333531 是 PKCβ 选择性抑制剂，其是否对高氧诱导的肺泡上 皮细胞具有保护作用，是否能减轻高氧诱导的肺 泡上皮细胞的损伤，国内外文献未见报道。 1 材料与方法 1.1 A549 细胞传代培养与分组

A549 细胞由泸州医学院附属医院中心实验 室提供；A549 细胞复苏后，加入含10% 胎牛血 清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，中 国） 的DMEM（H） 培养液（Hyclone 公司，美 国），置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱 中培养。待细胞生长达对数生长期时，在生物安 全柜FORMA1285（ 美国Thermo） 中进行操作， 以0.25% 胰蛋白酶（碧云天公司）消化，传代接 种于50 mL 的细胞培养瓶中，随机分为对照组、 高氧组和LY333531 组。对照组仍置于37℃、5% CO₂ 培养箱中；高氧组换液后，以3 L/min 流速 通入950 mL/L 的O₂ 和50 mL/L 的CO₂ 高纯混合 气，10 min 后密闭培养；LY333531 组用终浓度为 10 μmol/L 的等量PKCβ 抑制剂LY333531 培养液 （美国Alexis 公司）预处理24 h 后，再用高氧诱 导A549 细胞，10 min 后密闭培养，24 h 后收获细胞。 其中高氧组在培养结束时用ML-IICB 数字智能测 氧仪（北京航天鹏诚仪器仪表有限公司）检测培 养瓶中氧浓度，低于90% 的标本弃去。 1.2 Western blot 检测细胞PKCβ、Pin1、 P66Shc 和P66Shc-Ser36 的表达

Western blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检 测物是蛋白质，“探针”是抗体（均购自ABcam 公司， 美国），“显色”用标记的二抗。经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（NC 膜）上， 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应 的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二 抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测 蛋白水平的表达。每组重复6 次，用UVP 凝胶图 象处理系统Labworks4.6 软件分析目的条带灰度值。 1.3 激光共聚焦显微镜检测P66Shc 在线粒体内的转位

收集各组细胞，采用“MitoTracker”作为分子 探针标记线粒体（绿色荧光），特异性的抗-P66Shc 的荧光抗体标记P66Shc（红色荧光），用激光共 聚焦显微镜观察P66Shc 蛋白在线粒体内的表达情 况。发射波长为510 nm 及580 nm。每组重复8 次， 计算转位率。 1.4 激光共聚焦显微镜检测线粒体ROS 产生

MitoSox Red 是一种高选择性的检测线粒体内 ROS 的荧光染料，可自由透过活细胞膜进入细胞 内并选择性靶向线粒体，被线粒体内的超氧阴离 子ROS 氧化产生红色荧光。用激光共聚焦显微镜 检测红色荧光反映线粒体ROS 产生的情况。发射 波长为510 nm 及580 nm。使用Image-pro 6.0 图像 分析软件分析图像。每组重复8 次，确定平均光 密度（AOD），进行统计分析。 1.5 激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化

线粒体膜电位（Ψm △）的测量采用JC-1 荧 光探针染细胞，按线粒体膜电位检测试剂盒（碧 云天公司，中国）说明操作。首先用JC-1 这种阳 离子染料对线粒体膜进行染色，再用激光共聚焦 显微镜检测。发射波长为530 nm 及590 nm。使用 Image-pro 6.0 图像分析软件分析图像。每组重复10 次，确定AOD，进行统计分析。 1.6 统计学分析

采用SPSS 18.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，多 个样本均数的比较采用单因素方差分析，组间两 两比较采用LSD-t 检验，P<0.05 为差异有统计学 意义。 2 结果 2.1 高氧对A549 细胞内PKCβ 表达及LY333531

对高氧诱导A549 细胞内Pin1、P66Shc 和 P66Shc-Ser36 表达的影响 与对照组相比，高氧处理24 h 后A549 细胞 内PKCβ、Pin1、P66Shc 和P66Shc-Ser36 表达均 显著增加（均P<0.05）；LY333531 处理组Pin1、 P66Shc和P66Shc-Ser36表达较高氧组均显著降低， 但仍高于对照组（均P<0.05）。见图 1，表 1。

图 1 Western blot 条带图A： 高氧诱导下A549 细 胞内PKCβ 的表达；B：LY333531 对高氧诱导A549 细胞Pin1、 P66Shc 及P66Shc-Ser36 表达的影响。

表 1(Table 1)

表 1 各组细胞内PKCβ、Pin1、P66Shc 和P66Shc-Ser36 表达水平比较　（x±s）

表 1 各组细胞内PKCβ、Pin1、P66Shc 和P66Shc-Ser36 表达水平比较　（x±s）

高氧组细胞P66Shc 线粒体转位率明显高 于对照组（P<0.05）； 而LY333531 组较高氧组 P66Shc 线粒体转位率显著降低，但仍高于对照组 （P<0.05）。见图 2，表 2。

图 2　LY333531 对高氧诱导A549 细胞P66Shc 在线粒体内转位的影响（激光共聚焦显微镜，×400）胞浆中线粒体绿色荧光与P66Shc 红色荧光重叠合成黄色荧光，代表P66Shc 已经发生转位；反之，胞浆中红色荧光与 绿色荧光未发生重叠而相互分离，代表P66Shc 未发生转位。对照组红绿荧光分离较多，代表P66Shc 在线粒体内的转 位率低，高氧组红绿荧光重叠，代表P66Shc 在线粒体内的转位率高，LY333531 组转位率较高氧组降低，但仍高于对 照组。

表 2(Table 2)

表 2　各组细胞P66Shc 线粒体转位率、ROS 产生和线粒体膜电位变化比较　（x±s）

表 2　各组细胞P66Shc 线粒体转位率、ROS 产生和线粒体膜电位变化比较　（x±s）

高氧组线粒体ROS 显著高于对照组（P<0.05）， 并可见部分细胞核碎裂；而LY333531 组线粒体 ROS 较高氧组显著降低，但仍高于对照组（P<0.05）。 见图 3、表 2。

图 3　LY333531 对高氧诱导A549 细胞线粒体ROS 产生的影响（激光共聚焦显微镜，×400）激光共聚 焦显微镜下线粒体ROS 呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。高氧组红色荧光明显增多，代表线粒体ROS 显著高于对照组，而 LY333531 组线粒体ROS 较高氧组显著降低，但仍高于对照组。

高氧组细胞内的线粒体膜电位较对照组明显 降低（P<0.05）；而LY333531 组线粒体膜电位较高氧组显著升高，但仍低于对照组（P<0.05）。见 图 4、表 2。

图 4　LY333531 对高氧诱导A549 细胞线粒体膜电位的影响（激光共聚焦显微镜，×400）线粒体膜电位降 低时，在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光，线粒体膜电位增高时呈红色荧光，判断线粒体膜电位高低以红、绿荧光的比值来表示。 可见与对照组相比，高氧组线粒体膜电位降低，LY333531 组线粒体膜电位较高氧组有所升高，但仍低于对照组。

近年来，随着早产儿出生率的显著提高及呼 吸机的广泛使用，长期高浓度供氧气所引起的急、 慢性肺损伤是造成早产儿尤其是极低出生体重儿 死亡或致残的重要原因。研究表明，在高氧环境 下线粒体发生氧化应激反应，产生大量ROS 是其 发病的重要机制^{[7, 8, 13]}。P66Shc 作为哺乳动物生命 周期相关蛋白，是近年来研究细胞氧化应激的关 键蛋白，其主要功能是调节细胞氧化应激反应和调控生命周期^[9]。Pin1 是人类的肽基脯氨酰异构酶， 能特异地识别和结合蛋白质磷酸化的丝/ 苏- 脯氨 酸基序，催化磷酸化的丝/ 苏- 脯氨酸肽键发生顺 反异构，从而改变磷酸化蛋白质的功能^{[9, 14]}。

本实验传代培养人肺泡上皮来源的A549 细胞 并建立高氧损伤细胞模型，主要探讨PKCβ/P66Shc 途径对线粒体的氧化损伤。结果显示，高氧处理 24 h 后，PKCβ、Pin1、P66Shc 和磷酸化P66Shc- Ser36 的蛋白表达量都明显高于对照组；且P66Shc 的转位率明显升高，ROS 产生增多，膜电位明显 下降，推测高氧诱导线粒体产生ROS 的机制与 PKCβ/P66Shc 途径有关。在高氧刺激下，首先活化 PKCβ，使胞浆内的 P66Shc 发生磷酸化，进而被 Pin1 识别发生异构化（Pin1 介导P66Shc 的线粒体 转位），在蛋白磷酸酶2A 的作用下去磷酸化进入 线粒体，活化的P66Shc 转移到线粒体呼吸链酶复 合体Ⅲ氧化细胞色素C 产生ROS/H₂O₂ ^{[10, 11]}。

氧化应激如何激活线粒体信号通路介导凋 亡发生？当ROS 超出其可承受的临界值后，便 诱导线粒体膜的渗透性改变和细胞色素C、Omi/ HtrA2 等的释放^{[6, 15]}。凋亡因子被释放至细胞质， 它们或独立地破坏核内染色质，或激活凋亡蛋白 家族的主要成员- 胱冬肽酶，或作用于其他Ca²⁺ 依赖性蛋白，使整个细胞的结构破坏、功能紊 乱，最后细胞变成泡状凋亡小体而凋亡^[16]。由此 可见PKCβ/P66Shc 氧化应激信号通路是作为线粒 体前途径介导了细胞的凋亡。同时，本实验采用 PKCβ 特异性抑制剂LY333531 阻断P66Shc 磷酸化 后，虽经过高氧干预，但A549 细胞中P66Shc 的 转位率（胞浆转移到线粒体）明显降低，ROS 产 生减少，膜电位明显有所上升，PKCβ 特异性抑 制剂LY333531 能明显抑制Pin1、P66Shc、磷酸 化P66Shc-Ser36 蛋白的表达。LY333531 其对氧化 应激状态下的A549 细胞具有的保护作用及其对 Pin1、P66Shc、P66Shc-Ser36 蛋白表达的影响更进 一步证明了PKCβ/P66Shc 氧化应激信号通路介导 高氧诱导肺泡上皮细胞内活性氧产生的作用。本 研究中LY333531 对高氧肺损伤的保护作用，为临 床治疗高氧肺损伤提供一定的理论依据。