新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是由于各种围生期窒息引起 的部分或者完全缺氧，脑血流减少或者暂停而导 致胎儿或新生儿脑损伤性疾病，是引起新生儿急 性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一^[1]。 本病发病机制比较复杂，细胞内钙超载是目前 比较认同的引起HIBD 的机制之一，而钙网蛋白 （calreticulin,CRT）作为内质网中的一种多功能分 子伴侣，在维持细胞内Ca²⁺ 稳态中发挥重要作用。 目前研究认为：坏死和凋亡是HIBD 时神经元死亡 的两种主要形式，脑缺氧缺血导致的迟发性神经 元死亡主要与细胞凋亡有关^[2]。

参附注射液的主要成分是人参皂甙和乌头类 生物碱，对心血管系统、缺血再灌注损伤、免疫系 统以及抗肿瘤治疗等具有良好的保护作用。近年来 研究发现参附注射液对颅脑损伤也有很好的保护 作用^[3]，王军等^[4] 前期研究发现参附注射液能减少 HIBD 新生大鼠海马神经元凋亡的发生。但其对于 HIBD 后CRT 表达以及细胞内Ca²⁺ 的影响如何，国 内外尚未见报道。本实验参照Rice 法^[5] 建立HIBD 模型，观察参附注射液对HIBD 后皮质区Ca²⁺ 相关 蛋白CRT 表达及神经元凋亡的影响，探讨参附注 射液在HIBD 新生大鼠中可能的脑保护机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物

7 日龄新生Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重 12~16 g，雌雄不限，由徐州医学院实验动物中心 提供。 1.2 主要试剂

Trizol Reagent 试剂为Invitrogen 公司产品， RT-PCR 试剂盒购于北京天根生化科技有限公司， 引物及内参均由上海生工生物技术服务有限公司 提供；兔抗鼠CRT 多克隆抗体购于美国CST 公司， 羊抗兔二抗以及β-actin 一抗、二抗均购于北京中 杉金桥生物技术有限公司；Fura-2/AM 由Sigma 公 司生产，参附注射液由雅安三九药业有限公司生 产（批号：Z20043116）。 1.3 动物模型的制备及分组

新生SD 大鼠随机分为对照组、缺氧缺血组和 参附干预组。参照Rice 法^[5] 制作HIBD 模型：将 新生7 d SD 大鼠用无水乙醚吸入麻醉后，取仰卧 位，四肢固定于手术板上，颈正中线切开皮肤， 游离右侧颈总动脉，丝线结扎，缝合切口，造成 缺血；回窝休息2 h，再置于一体积为2 000 mL、 底部铺有CO₂ 吸收剂钠石灰、与混合气体相连的 密闭有机玻璃箱内；将该容器置于37℃水浴中， 以1~2 L/min 的速度输入含8% 氧气、92% 氮气的 混合气体，持续2 h，造成缺氧。对照组只做颈部 切开和右侧颈总动脉分离术，不结扎，缝合切口 后呼吸正常空气。参附干预组于造模成功后立即 腹腔注射参附注射液（10 mL/kg），每日1 次， 连用3 d。缺氧缺血组于造模成功后与对照组一同 行等量生理盐水腹腔注射。各组按照观察时间点 不同进一步分为缺氧缺血后3、6、12、24、72 h 5 个亚组，每组均10 只，其中8 只用于基因、蛋白、 Ca²⁺ 浓度及凋亡率的检测，另外2 只用于苏木精- 伊红（HE）染色。 1.4 HE 染色标本制备

分离出各组新生大鼠的右侧大脑半球标本， 常规固定、脱水、石蜡包埋后，为了具有可比性， 统一取相当于耳间前线2 mm 水平（即相当于大脑 中后1/3 部位）行冠状位脑组织切片，采用HE 染色， 光镜下观察皮层脑组织病理变化。 1.5 RT-PCR 检测CRT mRNA 含量

取新鲜大脑皮层标本，用TRIzol 试剂提 取总RNA，采用逆转录试剂盒，按照说明书 操作步骤进行逆转录反应。CRT 引物序列： 上游5'-CAAGGATATCCGGTGTAAGGA-3'， 下游5'-CATAGATATTCGCATCGGGG-3'，产 物长度445 bp； 内参β-actin 引物序列： 上 游5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，下游 5'-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3'，产物长度 229 bp。PCR 反应体系（25 μL）：cDNA 3 μL， 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR 扩增条件为：94℃预变 性3 min；94℃变性30 s，55℃（CRT）/57℃（β-actin） 退火30 s，72℃延伸1 min，30 个循环；72℃再延 伸7 min 终止反应。取5 μL PCR 产物在1.5% 琼脂 糖凝胶电泳后，用凝胶成像分析系统扫描、拍照， 结果以目的基因与内参基因条带灰度值比值表示。 1.6 Western blot 检测CRT 蛋白含量

取新鲜右侧大脑皮层组织，用RIPA 裂解液裂解蛋白，BCA 法蛋白定量。上样后SDS-PAGE 凝 胶电泳，半干转法转NC 膜。一抗（1 : 100）4℃孵 育过夜后孵育二抗。DAB 法显色后拍照，用Image J 图像分析系统测条带灰度值，并做统计学分析。 1.7 脑细胞内游离Ca²⁺ 浓度测定

于不同时间点将各组新生大鼠快速断头取脑， 至于冷Hank's 液中（pH 7.4），分离右侧大脑皮层， 冲洗后剪碎，加适量0.125% 胰酶消化3~5 min 后 用含10% 小牛血清的DMEM 终止消化，200 目过 筛后1 500 r/min 离心5 min，弃上清，将脑细胞 悬浮于Hank's 液中制成脑细胞悬液。取上述悬液 1.5 mL 中加入1 mmol/L 的Fura-2/AM 7.5 μL，37℃ 恒温振荡孵育40 min，用Hank's 液洗涤2 次，最 后Hank's 液（pH 7.0）悬浮，用毛细吸管吸取细 胞悬液滴一滴于洁净载玻片上，盖上盖玻片静置 2 min，荧光显微镜观察脑细胞，荧光图像分析系 统检测单个脑细胞荧光强度，激发波长为340 nm 和380 nm，发射波长为505 nm，F340 nm/F380 nm 比值测定胞浆Ca²⁺ 浓度。 1.8 流式细胞术检测各组大脑皮层神经元凋亡率

新鲜大脑皮层组织置于PBS 中轻柔剪碎，放 离心管中用PBS 稀释为4 mL，反复吹打20 次，沉 淀5 min，取上清，经200 目尼龙网过滤2 次，制 成单细胞悬液，以700 mL/L 乙醇4℃固定12 h， 上机前再用PBS 稀释，再次离心去上清，加入PI 染液，4℃避光放置30 min，24 h 内应用流式细胞 仪检测。 1.9 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学比 较分析，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示， 多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采 用LSD-t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 HIBD 大鼠一般情况

缺氧约10 min 后，所有新生大鼠开始烦躁不 安，随即出现全身发绀，呼吸加深加快，进而站 立不稳，爬行时左后肢呈拖步；缺氧时间达30 min 以上后，活动明显减少；1 h 后出现嗜睡及激惹。 2.2 脑组织病理改变

缺氧缺血72 h 时间点脑组织切片经HE 染色 后行光学显微镜下观察发现：对照组脑组织结构 及细胞层次清晰，神经细胞排列整齐紧密，形态 正常；缺氧缺血组病变区脑组织细胞间隙增大， 细胞稀疏，水肿明显，表现为细胞体积增大，胞 质疏松、淡染，部分细胞严重水肿，胞质透明如 气球，呈气球样变，并伴有细胞坏死，表现为核 固缩、核碎裂等；参附干预组细胞排列尚规则， 体积稍大，呈轻度水肿改变，见图 1。

图 1 缺氧缺血72 h 各组右侧脑皮质区病理改变（苏木精- 伊红染色，×400）对照组细胞排列紧密，形态正 常；缺氧缺血组细胞排列稀疏，体积增大，胞质淡染，部分透明如气球，伴核固缩、核碎裂等；参附干预组细胞排列尚规则， 体积稍大，呈轻度水肿改变。

缺氧缺血组及参附干预组各时间点CRT mRNA 及蛋白的表达水平均较对照组升高 （P<0.05）；与缺氧缺血组相比较，参附干预组各 时间点CRT mRNA 及蛋白的表达水平升高更加明 显（P<0.05）。CRT mRNA 表达高峰出现在造模 后12 h，CRT 蛋白表达高峰出现在造模后24 h。 见图 2~3。

图 2　RT-PCR 检测各组不同时间点CRT mRNA 的表达A 为各组不同时间点CRT mRNA 电泳条带图。B 为各组不 同时间点CRT mRNA 表达量的统计柱状图（n=8）；a 示与对照组 比较，P<0.05；b 示与缺氧缺血组比较，P<0.05。

图 3　Western blot 检测各组不同时间点CRT 蛋白的表达　A 为各组不同时间点CRT 蛋白条带图。B 为各组不同时 间点CRT 蛋白表达量的统计柱状图（n=8）；a 示与对照组比较， P<0.05；b 示与缺氧缺血组比较，P<0.05。

缺氧缺血组各时间点脑细胞内游离Ca²⁺ 浓度 较对照组明显升高（P<0.05），并随着时间推移， 游离Ca²⁺ 水平升高逐渐明显；予参附注射液干预 后，细胞内游离Ca²⁺ 浓度较缺氧缺血组明显下降， 但仍高于对照组（P<0.05），且游离Ca²⁺ 水平随 时间推移逐渐升高。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组不同时间点右侧脑皮层细胞胞浆内游离Ca2+ 浓度的变化　（x±s）

表 1 各组不同时间点右侧脑皮层细胞胞浆内游离Ca2+ 浓度的变化　（x±s）

对照组各时间点脑皮层神经元凋亡率极低； 缺氧缺血组和参附干预组各时间点神经元凋亡率 均较对照组明显升高（P<0.05）；而与缺氧缺血组 相比较，参附干预组各时间点的神经元凋亡率则 明显降低，但仍高于对照组（P<0.05）；缺氧缺血 组和参附干预组均在缺氧缺血后12 h 神经元凋亡 率最高。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2　各组不同时间点右侧大脑皮层神经元凋亡率比较　（x±s）

表 2　各组不同时间点右侧大脑皮层神经元凋亡率比较　（x±s）

缺氧缺血导致的脑损伤一般分为原发性损伤 （窒息后4~6 h）和更为剧烈持久的继发性损伤（窒 息后6~72 h）两个阶段，因此本研究选择缺氧缺 血后3、6、12、24 以及72 h 作为观察点。无论原 发损伤还是继发损伤都会因能量衰竭造成Na⁺-K⁺- ATP 失活，最终均导致大量Ca²⁺ 内流，造成Ca²⁺ 超载，从而介导细胞内一系列依赖Ca²⁺ 的生化 反应，诱导神经元凋亡。CRT 是内质网中主要的 Ca²⁺ 结合蛋白，通过调节内质网 Ca²⁺ 贮存而影响 细胞浆游离Ca²⁺ 水平，并作为内质网分子伴侣参 与蛋白质折叠，具有调节Ca²⁺ 稳态、蛋白质折叠、 细胞凋亡等多种生物学功能。CRT 能与Ca²⁺-ATP 酶（sarco endoplasmic reticulurn calcium ATPase, SERCA）糖基化的C- 端末尾直接作用，当内质网 中Ca²⁺ 耗竭时，两者解离，ATP 酶活化，回收胞 浆内Ca²⁺；当内质网中Ca²⁺ 充足时，两者结合， 抑制ATP 酶活性，胞浆内Ca²⁺ 向内质网转运停 止，提示CRT 可能通过SERCA 来调节Ca²⁺ 稳态。 目前文献中关于CRT 在缺血缺氧、氧化应激等致 细胞凋亡中的作用尚有争议。有报道认为CRT 参 与了应激细胞的保护：Liu 等 ^[6] 研究发现，在创伤 后应激障碍大鼠海马中，胞浆内游离Ca²⁺ 浓度升 高，Ca²⁺ 平衡失调，CRT 表达升高，参与Ca²⁺ 超 载与内质网应激的调节，减轻了细胞损伤。在微 波辐射诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤模型 中，外源性CRT 可以通过减轻内质网应激反应来 起到保护作用^[7]。与上述研究相反，有报道认为 CRT 过表达增加细胞对凋亡刺激的敏感性：Lopez Sambrooks 等^[8] 证实了细胞膜上的CRT 增加了细 胞凋亡的敏感性。Shi 等^[9] 通过对先兆子癎患者胎 盘的研究发现，CRT 能促进肿瘤细胞的凋亡，抑 制肿瘤细胞的增殖与侵犯。本研究发现，新生大 鼠脑皮层中CRT 的表达在缺氧缺血后3 h 即已明 显增加，其基因表达在缺氧缺血后 12 h 达到高峰， 蛋白在24 h 达到高峰，随后逐渐下降，72 h 仍明 显高于对照组。因此可以推测CRT 相关信号转导 通路在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮层中被 激活。

参附注射液源于参附汤，是由红参和附片经 提取加工后制成的注射液，其主要成分为人参皂 甙和乌头类生物碱。近年来研究发现参附注射液 具有多种药理作用和神经保护作用，其机制为： 清除氧自由基，抑制脂质过氧化物的产生；抑制 过量Ca²⁺ 内流，减轻钙超载；降低炎症因子，减 轻炎症反应；上调BCL-2 表达，抑制细胞凋亡等^[10]。 李锋等^[11] 研究表明参附注射液在低（5 mL/kg）、 中（10 mL/kg）、高（20 mL/kg）不同剂量经腹腔 注射后对SD 大鼠颅脑损伤均有保护作用，且无剂 量效应关系，再结合预实验结果，本研究选择中 等剂量的参附注射液（10 mL/kg）。此次研究结果 显示：与缺氧缺血组相比较，参附干预组脑组织 病理损伤明显减轻，而且皮层区神经元的凋亡率 显著下降，此外，参附干预组各时间点CRT 表达 量均高于缺氧缺血组，胞浆Ca²⁺ 浓度明显低于缺 氧缺血组，提示参附注射液可能通过上调CRT 的 表达，降低钙超载来减少神经元凋亡，从而起到脑保护作用。

综上所述，本次试验结果显示缺氧缺血后新 生大鼠脑皮层胞浆内Ca²⁺ 浓度上升，CRT 表达增加， 表明缺氧缺血造成了细胞内钙超载，并且激活了 Ca²⁺ 相关蛋白CRT。用参附注射液干预后CRT 表 达升高更加明显，同时胞浆内Ca²⁺ 浓度明显下降， 而大脑皮层神经元凋亡率下降，脑组织病理损伤 减轻，因此推测参附注射液可能通过上调CRT 的 表达、降低Ca²⁺ 超载来发挥神经保护作用。当然， 参附注射液是否还存在其他神经保护机制？ CRT 是否通过SERCA 来减轻钙超载？这些问题需要进 一步研究。