急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童时期最常见的恶性肿瘤，目前许多发达国家治愈率接近90%^{[1, 2, 3]}，国内大型儿童白血病诊疗中心也已达到70%~80%^{[4, 5]}。白血病相关融合基因的研究作为白血病特异性的分子标志物之一，不但在分子水平上进一步阐明了白血病的发病机制，更为临床评价治疗效果、判断预后、制订个体化的化疗方案提供科学的依据。儿童ALL中最常见的融合基因包括t(12;21)易位形成的TEL/AML1融合基因、t(1;19)易位形成的E2A/PBX1融合基因、t(9;22)易位形成的BCR/ABL融合基因以及t(4;11)易位形成的AF4/MLL融合基因^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}。其中前两对融合基因在B细胞性ALL患儿中发生率最高，AF4/MLL融合基因则在婴儿白血病中占2/3以上。以往国内的研究大多采用巢式RT-PCR的方法^{[12, 13, 14]}，作为临床常规手段显得费时费力，本研究采用单管一步法多重RT-PCR一次扩增并同时检测上述儿童ALL中最常见的4对融合基因，取得较好的检测效果，具体报道如下。

选取2003年1月至2010年12月本院确诊的76例ALL初发患儿为研究对象，其中男53例，女23例，年龄范围5 d~12岁，中位年龄4.13岁。ALL的诊断及FAB分型标准参照小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第二次修订草案）^[15]；68例患儿接受流式细胞免疫分型，其中B细胞型64例，T细胞型3例，NK细胞型1例。2005年6月以前，化疗方案按小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第二次修订草案）^[15]进行，以后按GZ2002 ALL化疗方案^[4]进行。本研究已获得患儿家属知情同意。

抽取ALL患儿化疗及输血前骨髓液（白血病细胞比例占80%以上）1~1.5 mL，使用QIAamp^® RNA Blood Mini Kit（QIAGEN，德国）抽提或采用TRIzol（INVITROGEN，美国）提取总RNA，紫外分光光度计测定浓度和纯度。1 μg总RNA使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（大连宝生物公司）逆转录获取cDNA。

（1）一步法多重RT-PCR：E2A/PBX1、AF4/MLL、BCR/ABL和TEL/AML1融合基因及内参18S RNA的引物设计参照文献^{[16, 17]}（表 1），引物由上海英骏生物技术有限公司合成，采用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（大连宝生物公司）试剂盒行RT-PCR。反应体系（25 μL）：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，2×One Step Buffer 12.5 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，RNA模板0.5 μL，余体积用ddH₂O补足。反应条件：50℃逆转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，循环35次；72℃延伸6 min。

（2）巢式PCR：引物设计参照文献^[17]（表 2），由上海英骏生物技术有限公司合成。以cDNA为模板进行两轮PCR。第一轮PCR反应体系（25 μL）：cDNA模板1 μL，10×Ex Taq缓冲液2.5 μL，dNTP混合物2 μL，上下游引物各0.5 μL，EX Taq DNA聚合酶0.25 μL，余体积用ddH₂O补足。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，循环30次；最后72℃延伸6 min。第二轮PCR 反应体系（25 μL）：模板（第一轮PCR产物）0.5 μL，10×Ex Taq缓冲液2.5 μL，dNTP混合物2 μL，上下游引物各0.5 μL，EX Taq DNA聚合酶0.25 μL，余体积用ddH₂O补足。反应条件为：除退火温度改为58℃外，其他条件与第一轮相同。PCR反应均在Tprofessional Std Gradient 96扩增仪（Biometra公司，德国）上扩增，扩增产物以15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，电泳25 min 后，于凝胶成像系统进行分析。

对在分析中发现的有异常条带的样本进行DNA测序分析验证，测序由上海生工或大连宝生物公司完成。

一步法多重RT-PCR对ALL患儿最常见的4对融合基因进行检测，结果显示TEL/AML1融合基因阳性12例（产物长度298 bp 9例，259 bp 3例），E2A/PBX1融合基因阳性3例（产物长度373 bp），BCR/ABL融合基因阳性1例（产物长度2 124 bp），MLL/AF4融合基因阳性7例（产物长度427 bp 1例，673 bp 6例）。各种长度片段代表性电泳图谱见图 1A，与常规巢式PCR方法检出结果一致（图 1B）。

图 1 两种方法检测融合基因琼脂糖凝胶电泳分析图 　A：一步法多重RT-PCR：M：DNA 分子标准；1：TEL/AML1 亚型（259 bp）；2：TEL/AML1 亚型（298 bp）；3：E2A/PBX1 亚型（373 bp）；4：MLL/AF4 亚型（427 bp）；5：MLL/AF4 亚型 （673 bp）；6：BCR/ABL 亚型（2 124 bp）；7：未检测到4 种融 合基因的阴性标本（仅有187 bp 片段）。泳道1~7 中187 bp 的 条带为内参18S RNA 的PCR 扩增产物。B：巢式PCR：M：DNA 分子标准；1：TEL/AML1 亚型（142 bp）；2：TEL/AML1 亚型 （181 bp）；3：E2A/PBX1 亚型（289 bp）；4：MLL/AF4 亚型 （370 bp）；5：MLL/AF4 亚型（616 bp）；6：BCR/ABL 亚型（186 bp）。

针对两种较少见亚型融合基因扩增产物进行DNA测序，结果显示与预期相符。其中1例BCR/ABL亚型片段长度证实为2 124 bp，为M-BCR-ABL-b3a3型，即BCR基因外显子14与ABL基因外显子3的融合（e14e3）（图 2），此类型在儿童白血病中报道较少。6例MLL/AF4亚型片段长度均为673 bp，为MLL基因外显子11与AF4基因外显子4的融合（e11e4型）（图 3）。

图 2 　BCR 与ABL 基因融合位置的DNA 测序图 该融合基因左边部分为人类ABL 基因序列，右边部分为人类BCR 基因序列。

图 3 MLL 与AF4 基因融合位置的DNA 测序图 　该 融合基因左边部分为人类MLL 基因序列，右边部分为人类AF4 基 因序列。

76例ALL患儿中，TEL/AML1阳性12例（16%），其中11例为B系ALL；年龄1~11岁（中位年龄5.5岁），外周血WBC计数为2.8~74.7×10⁹/L（中位数10.5×10⁹/L）；10例阳性患儿接受治疗，第15天完全缓解（CR）7例（70%），随访5~36个月，无早期死亡病例。TEL/AML1阴性患儿64例，年龄5 d~9岁（中位年龄4.8岁），外周血WBC计数为5.3~139.3×10⁹/L（中位数29.6×10⁹/L）；42例阴性患儿接受治疗，第15天CR 25例（60%），随访4~45个月，早期死亡6例。

MLL/AF4阳性7例（9%），均为B系ALL；年龄5 d~6岁（中位年龄1.9岁），外周血WBC计数为15.3~139.3×10⁹/L（中位数39.5×10⁹/L）；3例阳性患儿接受治疗，第15天CR 1例，第33天CR 1例，分别随访37个月、42个月，未复发；1例33 d CR，随访47个月时骨髓复发后转其他院治疗。

E2A/PBX1阳性3例（4%），均为B系ALL；年龄10个月~10岁，外周血WBC计数为15.3~68.6×10⁹/L（中位数31.5×10⁹/L）；第15天CR 1例，第33天CR 1例，1例转他院治疗。

BCR/ABL阳性1例（1%），患儿女，7岁，外周血WBC计数为11.2 ×10⁹/L，FAB分型为L1型，免疫分型为B细胞型，转他院治疗。

白血病融合基因筛查检测国内报道不少，主要包括荧光原位杂交（FISH）和PCR方法^{[11, 12, 13, 14, 15, 16]}。PCR检测方法则大多采用巢式PCR，存在相对繁琐、易污染等缺点。本研究根据儿童白血病常见融合基因的分布特点，借鉴国外的一些相关研究，进行了更为简单的多重一步法RT-PCR检测常见儿童白血病融合基因的初步尝试。电泳及测序结果显示本研究中使用的简单的多重一步法RT-PCR能检测出4种目的融合基因，可为国内儿童常见白血病融合基因的快速筛查提供新的参考思路。

本次融合基因检测研究中，4种融合基因TEL/AML1、E2A/PBX1、BCR/ABL及MLL/AF4的检出率分别为16%、4%、1%和9%，与国内外报道基本一致^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}。本研究对两种较少见的融合基因亚型进行了测序证实，进一步确认了一步法多重RT-PCR的检出结果。综合相关融合基因断裂点等数据进行辅助判断，该方法在儿童ALL中应用还是有较大价值。对于条带较弱不能确定的标本，还可进行一到两种单重PCR进行验证。

4种融合基因中，TEL/AML1是小儿ALL最常见的基因改变，TEL-AML1阳性已作为临床低危的一项重要指标，与化疗敏感、复发率低相关。阳性组患儿初发时外周血WBC与阴性组患儿有差异，与朱晓华等^[12]及左英熹等^[18]的报道一致。本研究检测到7例MLL/AF4 基因异常，占9%，其中3例为婴儿白血病。MLL基因重排患儿预后极差，是临床高危的一项重要指标。本组3例携带MLL基因重排的患儿在我院进行了临床治疗，1例高危患儿，强烈化疗后已CR 3年8个月；另1例经诱导化疗15 d即达CR 3年；另1例经强烈化疗获得CR 47个月后骨髓复发，这提示临床对涉及MLL基因患者化疗应予强烈化疗，可改善近期疗效。本次研究检测到3例E2A/PBX1异常融合，采用强烈化疗，2例患儿均达CR。1例BCR/ABL患儿放弃治疗，未能进行有效观测。

近年来，白血病融合基因的检测主要以荧光定量PCR检测为主流发展方向，其主要优势在于灵敏度高、闭管分析无污染等特点，但它存在仪器昂贵、试剂成本检测费用高等缺点，特别在目标基因种类较多的基因筛查中更为凸显。因此常规PCR为基础的初筛系统还是非常必要，特别是在发展中国家、不发达地区。通过多重RT-PCR作为初筛手段，再结合荧光定量PCR追踪目的融合基因为靶标的微小残留病检测，应该是现阶段白血病融合基因检测的主流选择之一。本研究则是针对儿童急性淋巴细胞白血病融合基因的分布特点，对一步法多重RT-PCR初筛手段进行了优化，取得了较为理想的结果，有一定的推广价值。