智力低下（intellectual disability,ID） 在亚洲 人群的发病率大约为0.25%~1.3%[1-2]。ID 和生长发 育迟缓（developmental delay,DD）问题越来越受 到社会关注，已成为一个非常重要的公共健康问 题。导致ID/DD 的病因复杂，遗传异常是其重要 因素，但潜在的不明原因的ID/DD 仍然很多，大 约占30%~60%[3-4]。G 显带染色体核型分析作为首 选技术已广泛用于染色体异常的检测，但该方法 对于5 Mb 以下的染色体异常无法识别，而多重链 接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA） 能检出5%~10% 不明原因 ID/DD 患儿存在亚端粒区域基因拷贝数变异 （CNVs）^[5]，不适合检测未知的点突变及染色体 平衡易位，临床进一步治疗及受累家庭再生育风 险防范仍然困难重重。微阵列比较基因组杂交技 术（array-based comparative genomic hybridization, array-CGH）突破了传统细胞遗传学方法的许多限 制，已广泛应用于检测不明原因的非综合征性的 ID/DD^[6]，相比较传统的染色体核型分析，array- CGH 能检测到<5 Mb 的遗传变异^[7]。本研究共收 集不明原因的ID/DD 患儿16 例，采用array-CGH 技术进行全基因组扫描，以评估不明原因ID/DD 病例的遗传病因，为进一步诊治及遗传咨询提供 科学依据。 1　资料与方法 1.1　研究对象

研究对象为2012 年8 月至2014 年1 月来我 院儿童遗传咨询门诊或健康门诊就诊的不明原因 ID/DD 患儿16 例，根据ID/DD 诊断及筛查标准^[8]， 除外有明确病因的疾病，如明确的染色体核型异 常、遗传代谢性疾病、甲状腺功能异常、颅内肿瘤、 中枢神经系统感染、围产期异常导致的缺氧缺血 性脑病、已知遗传性综合征和遗传病等。所有患 儿均为临床病例，家属同意参与研究并签署知情 同意书，并获得医院伦理委员会批准。16 例患儿 均为汉族，平均年龄6 岁（范围2 个月至16 岁）， 其中男孩11 例，女孩5 例。 1.2　样本采集及预处理

在受试者安静状态下采集乙二胺四乙酸 （EDTA） 抗凝外周血2 mL，离心柱法提取基因组DNA，DNA 总量在50 μL 以上，浓度为 100~150 ng/μL，-20 ℃冰箱保存备用。 1.3　array-CGH 检测

取患儿基因组DNA 2 μg 与参考DNA 2 μg ， 用Alu I 和Rsa I 在37℃条件下联合消化2 h，进行 DNA 纯化。患儿基因组DNA 使用欧联红色荧光素 cy5-dCTP 标记，参照样本DNA 使用欧联绿色荧光 素cy3-dCTP 标记，标记后DNA 用MicroCon YM-30 进行样本纯化。将上述已纯化标记患儿DNA 与 参照DNA 等量混合，加入50 μg Cot-IDNA，再用 95% 乙醇沉淀，然后使用杂交液（50% 甲酰胺、 10% 硫酸葡聚糖、4% SDS、2*SSC、10 μg/μL 酵母 tRNA）溶解DNA 沉淀，最后将已溶解的DNA 置 于70℃变性10 min 等待杂交。上样到Oligo244K 芯片上65℃杂交炉孵育40 h，杂交后使用洗涤缓 冲液清洗芯片。使用Genepix 4200A 扫描仪扫描 微阵列芯片并获取杂交信号，采用Agilent Feature Extraction 9.1 进行数据提取至DNA Analytics 3.4 软 件进行统计分析，并依据统计结果设定DNA 拷贝 数变化的判断标准。以上操作步骤可按相应试剂 盒说明书进行（Agilent 公司）。 1.4　MLPA 检测

应用MLPA P064、P096 亚端粒区检测试剂盒 （MRC-Holland）验证array-CGH 检出的2 例综合 征病例，探针杂交、连接反应及探针扩增均参照 试剂盒说明进行，扩增产物经Beckman 遗传分析 仪（CEQ8000）进行毛细管电泳分离，GeneMarker v1.6 软件分析收集到的数据，得出MLPA 图谱。 2　结果 2.1　临床表现

16 例患儿中，6 例（38%）患儿有不同的异 常的面部特征（高前额、宽眼距、低鼻梁、厚嘴唇、 小下颌等）；6 例（38%）伴有其他畸形，包括先 天性心脏病、多指或趾畸形、阴道闭锁、隐睾等。 所有患儿均完成了常规染色体G 显带检查，均未 见明显异常。16 例患儿临床表现见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 　16 例ID/DD 患儿临床资料及array-CGH 结果

表 1 　16 例ID/DD 患儿临床资料及array-CGH 结果

6 例（38%） 患儿存在CNVs。经比对 DECIPHER 数据库和既往MR/DD 或ID/DD 相 关array-CGH 研究报告，2 例明确病因，其中1例CNVs 涉及4p16.3 区域微缺失，考虑为Wolf- Hirschhorn 综合征，另1 例CNVs 涉及7q11.23 区 域微缺失，考虑为Williams-Beuren 综合征。3 例 CNVs 为正常多态性改变。1 例CNVs 临床意义不 明确，包含2 个重复突变，患儿父母经array-CGH 检测均未发现相同CNVs 改变，考虑为新生突变。 经文献查询及表型- 基因型分析，该突变包含 ARHGAP、GTDC1、KYNU、LRP1B、WDR72 等基因， 与智力低下、脑发育迟缓、特殊面容（高眉弓、 低耳位、上睑下垂等）、隐睾、牙列不齐等有关， 证实该CNVs 具有临床意义。该区域所包含的基 因及相关临床表现见表 2（https://decipher.sanger. ac.uk/）。因此，array-CGH 技术为19%（3/16）的 患儿明确了病因诊断（表 1）。

表 2(Table 2)

表 2 2 个新生突变区域所包含的基因及相关临床表现/span>

表 2 2 个新生突变区域所包含的基因及相关临床表现

正常人的MLPA 分析图谱的扩增点范围在 （0.7~1.3）之间，小于0.7 表明拷贝数缺失，大于1.3 表明拷贝数扩增，对array-CGH 检出的2 例综合征 阳性病例经过验证，结果与之符合。 3　讨论

染色体CNVs 在神经性发育障碍，如ID、 DD、孤独症、精神分裂症以及其他疑难症等发 病机制中起重要作用^[9]。有报道，在因较小染色 体不平衡畸变而引起的ID、器官畸形和DD 的群 体中，常规G 显带核型分析技术的检出率约为 15%~40%^[10]。array-CGH 技术突破了传统细胞遗传 学方法的许多限制，通过对人类全基因组扫描， 可检测染色体非整倍数变异、CNVs 和染色体不 平衡异位，相比较传统的染色体核型分析，array- CGH 具有高通量、高分辨率等优点，可检出染色 体的亚显微缺失和重复突变[11-13]。国外文献报道， 在针对ID、多发性先天性畸形等患者的产后遗传 诊断中，array-CGH 的检出率为7%~11%^{[14, 15]}，可 检测出92% 以上常规细胞遗传技术可检测到的基 因失衡，以及8% 的常规技术和原位杂交技术未能 检测到的基因失衡^[15]。本研究利用array-CGH 技 术对不明原因ID/DD 患儿行全基因组扫描，发现 6/16 例（38%）患儿存在CNVs 异常，为19%（3/16） 的患儿明确了病因诊断。

Wolf-Hirschhorn 综合征又称4 号染色体短臂 末端亚端粒缺失综合征，约70% 的患者为新发缺 失，仅10%~15% 的患者父母为染色体平衡异位携 带者^{[16, 17]}。Wolf-Hirschhorn 综合征相对较罕见，发 生率为1/50 000，50%~100% 的患儿伴有癫癎，典 型的面部特征为希腊头盔样面容，宫内或出生后 生长发育迟缓、肌张力低下、骨骼畸形、先天性 心脏病、听力丧失、泌尿及胃肠道畸形等也较常 见^{[18, 19]}。例1 为5 个月男婴，以智力落后、特殊面容、 先天性心脏病、腭裂为主诉就诊，经array-CGH 分 析，发现染色体4p16.3 有一约1.95 Mb 缺失，该 区域的缺失是目前唯一明确的Wolf-Hirschhorn 综 合征致病基因，因此该患儿Wolf-Hirschhorn 综合 征诊断明确。

Williams-Beuren 综合征是因7 号染色体长臂 近着丝粒端片段7q11.23 微缺失引起，以认知缺陷、 轻度精神发育不良和主动脉狭窄为主要特点，还 可有特殊面容（宽前额、低鼻梁、星状蓝色巩膜、 长人中、大嘴、下唇突出、尖下巴、牙齿稀小， 又称“精灵脸”）、高钙血症、继发性高血压等 表现，发病率为1/20 000~1/7 500^[20]。ELN（弹性蛋白基因）缺失可导致主动脉发育不良，进而引起 主动脉瓣上狭窄，是Williams-Beuren 综合征的特 征性改变；GTF2I 基因与认知能力、分离焦虑有关； GTF2IRD1 与视动整合能力有关； 而GTF2IRD1/ GTF2I 基因簇参与面部异形化改变。Williams- Beuren 综合征早期生理表现轻微、不明显，缺乏 典型的临床表现，初次诊断从16 个月到12 岁不 等，平均5 岁，由于他们多动、多话及过分友好 的性格很容易被人忽略他们的智力问题^[21]。例2 为2 岁男性幼儿，因智力运动发育落后、特殊面 容、双侧隐睾就诊，染色体核型分析无异常，经 array-CGH 分析，发现染色体7q11.23 存在一大小 约1.61 Mb 微缺失，该区域存在多个致病基因，如 CLIP2、ELN、LIMK1、FKBP6、GTF2IRD1/GTF2I 基因簇和EIF4H 等基因，均与Williams-Beuren 综 合征有关，经完善血生化、心脏超声、眼底、视 力等相关检查，发现该患儿还存在主动脉狭窄、 高钙血症，因此患儿诊断Williams-Beuren 综合征 明确，但体查并未发现患儿心脏各瓣膜区明显病 理性杂音，且临床无紫绀等表现，需定期复查心 脏超声及血钙、血压等指标评估病情变化，及时 手术，延长存活时间。

Mulatinho 等^[22] 报道，在染色体2q22.1q22.3 区域存在8 个基因，包括：HNMT、SPOPL、 NXPH2、LOC64702、LRP1B、KYNU、ARHGAP15 和 GTDC1，并证实该部位的缺失与智力低下、先 天性畸形和孤独症等疾病有关。本研究通过比对 DECIPHER 数据库发现染色体2q22.2 重复区域主 要包括LRP1B、KYNU、ARHGAP15 和 GTDC1 共 4 个基因，Lynn 等^[23] 报道，LRP 1B 是儿童肥胖遗 传易感基因之一，Timms 等^[24] 通过array-CGH、连 锁分析、外显子测序等方法对3 个精神分裂症家 系检测发现，LRP1B 基因系罹患精神分裂症风险 相关的新基因。而染色体15q21.3 重复区域的主要 功能基因WDR72 与胼胝体、牙釉质等发育不良有 关。本研究中例3 患儿就诊时2.5 岁，表现为智力 运动发育落后、牙列不齐，array-CGH 检测发现染 色体存在2 个不同部位的重复突变，其包含的多 个基因均与其临床表现相符，故为致病突变，具 有临床意义，且为新生突变。该患儿年龄尚小， 将来有发生孤独症或精神分裂症等相关疾病的风 险，需要随访观察。

在不明原因ID/DD 中，利用array-CGH 技术 能检出致病性CNVs 约15%~20%，该技术目前已 作为一线诊断方法用于不明原因ID/DD 和（或） 先天性畸形的检测[25-26]。本研究中致病CNVs 检出 率为19%，与G 显带染色体核型分析相比，优缺 点各异，这就要求临床医生根据受检者具体情况 选择合适的检测手段，以达到利益最大化目的^[27]。