由于机械通气和肺表面活性物质的普遍应用 及早产儿管理技术的改进，危重新生儿存活率显 著提高。然而，由于呼吸障碍需要长时间吸入高 体积分数氧（高氧），可能引起肺部出现氧化应 激反应，继而发展至肺纤维化及支气管肺发育不 良，对患儿生活质量造成影响^[1]。

目前研究显示，细胞内产生过量活性氧 （reactive oxygen species,ROS） 是引起高氧肺损 伤的主要途径，而ROS 常通过以下两种途径产 生：一种是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADPH）途径，另一种是线粒体途径^{[2, 3]}。本课 题组前期研究表明，高氧可激活PKCβ，从而使 胞质内p66Shc 发生磷酸化，随后被Pin1 识别发生 异构化（Pin1 主要作用是介导p66Shc 在线粒体转 位），进而在蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）去磷酸化的作用下进入线粒体，活化 后的p66Shc 转移到线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ氧化 细胞色素C 产生ROS/H₂O₂ ^{[4, 5]}。因此推测，Pin1 可 在高氧条件下导致ROS 形成，继而在肺损伤中起 到重要作用。本课题组前期实验已成功构建Pin1- shRNA 慢病毒载体，并建立Pin1 稳定低表达的 A549 细胞系^[6]。本研究进一步探讨沉默Pin1 表达 是否抑制高氧诱导人肺泡上皮细胞的凋亡，为高 氧肺损伤治疗提供一种新的治疗方法。 1　材料与方法 1.1　细胞培养与分组

体外常规培养的人肺泡上皮细胞株（A549）， 随机分为对照组、高氧组、空载体组和Pin1- shRNA 组，对照组置于5% CO₂ 培养箱中常规培养， 高氧组、空载体组和Pin1-shRNA 组分别给予高体 积分数氧诱导细胞，即通入3 L/min 的95% 氧气和 5% 二氧化碳高纯混合气10 min，并在培养箱中密 闭培养24 h 后检测下述指标。 1.2　细胞形态学观察

各组细胞分别密闭培养24 h 后，在IX71 型倒 置相差显微镜下观察细胞的形态变化。 1.3　流式细胞术检测细胞凋亡率 按照凯基生物Annexin V-FITC 和PI 双染试 剂盒说明书进行细胞凋亡率检测。将上述分组 细胞密闭培养24 h 后，PBS 洗涤3 次，用不含EDTA 的胰酶消化制备单细胞悬液，调整细胞密 度为1×10⁶/mL，取1×10⁶ 个细胞加入500 μL 的 Binding Buffer 重悬细胞，再分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，混匀后室温下避光孵育反应 15 min。在激发光波长488 nm，发射波长530 nm 的流式细胞仪进行检测。在双变量流式细胞仪 的散点图上，右上象限为晚期凋亡细胞（FITC⁺/ PI⁺）；右下象限为早期凋亡细胞（FITC⁺/PI^-）； 左上象限为机械损伤细胞（FITC^-/PI⁺）；左下象限 为正常细胞（FITC^-/PI^-）。实验结果是以右上象限 和右下象限的细胞数之和与总细胞数之比计算凋 亡率。实验重复3 次，每组共8 个样本。 1.4　免疫组化法检测细胞凋亡相关蛋白的表达

采用SP 免疫组织化学法检测细胞凋亡相关 蛋白X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和胱冬肽酶 （Caspase）-9 蛋白的表达情况。实验中XIAP 和 Caspase-9 蛋白抗体的稀释度均为1 : 150。实验步 骤按照说明书进行操作，胞浆染成棕黄色为阳性 表达。实验重复3 次，每组随机选取8 张细胞爬片， 每张爬片任选8 个高倍镜视野，在倒置相差显微 镜下观察细胞，采用Image-Pro 6.0 图象分析软件 对图象进行分析，XIAP 和Caspase-9 表达水平以 其平均光密度值（AOD）表示。 1.5　荧光显微镜检测线粒体ROS 的含量

采用MitoSox Red（Molecular Probes^®） 作为 高选择性的线粒体内ROS 荧光染料，能够自由 透过活细胞膜进入细胞内并选择性靶向线粒体， 与线粒体内的超氧阴离子ROS 氧化产生红色荧 光。实验根据说明书步骤进行操作，细胞核采用 DAPI 染色呈蓝色荧光。荧光显微镜下观察并照相 （MitoSOX：510/580 nm，DAPI：340/488 nm）， 实验重复3 次，每组随机选取8 张细胞爬片，每 张爬片任选8 个高倍镜视野进行观察，使用Image- Pro 6.0 图像分析软件分析图像，测定AOD 以表示 ROS 含量。 1.6　荧光显微镜检测线粒体膜电位的变化

按照线粒体膜电位检测试剂盒说明书进行 操作。正常细胞中线粒体膜电位较高，JC-1 以 聚合物形式存在于线粒体的基质中，在发射波长 590 nm 下产生红色荧光。但当细胞受损时，线粒 体膜电位下降，JC-1 则不能聚集在线粒体的基质 中，以单体形式存在，在发射波长530 nm 下产生绿色荧光，通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转 变检测细胞膜电位的下降。JC-1 红色荧光与绿色 荧光的荧光度比值（红/ 绿）反映细胞线粒体膜电 位的高低。实验重复3 次，每组随机选取8 张细 胞爬片，每张爬片任选8 个高倍镜视野进行观察， 使用Image-Pro 6.0 图像分析软件分析图像，测定 AOD，以红/ 绿荧光强度比值表示线粒体膜电位高 低。 1.7　统计学分析

采用SPSS 19.0 统计分析软件对数据进行处 理，计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，多 组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采 用SNK-q 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　细胞形态学观察

通过倒置相差显微镜对细胞形态进行观察， 对照组细胞生长状态良好，活细胞数量多，少见 细胞漂浮，细胞呈梭形，细胞间隙较小，连接紧 密。高氧组及空载体组细胞均呈现出生长状态差， 活细胞数量明显减少，培养基中可见大量圆形细 胞漂浮，剩下的活细胞排列松散，间隙明显增宽。 Pin1-shRNA 组细胞生长状态欠佳，贴壁欠佳，但 活细胞数量较高氧组有所增加，悬浮细胞数较高 氧组减少，但是未达到对照组水平。 2.2　各组细胞凋亡率变化

流式细胞术检测结果表明与对照组相比，高 氧组和空载体组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）， 但两组间凋亡率的差异无统计学意义（P>0.05）。 Pin1-shRNA 组凋亡率较高氧组和空载体组显著降低（P<0.05），但仍高于对照组（P<0.001）。见图 1、表 1。

图 1 　高氧诱导A549 细胞凋亡的影响（流式细胞术双参数图）右上象限与右下象限细胞数之和占总细胞数比 值为细胞凋亡率。

表 1(Table 1)

表 1 各组细胞凋亡率比较（x±s）

表 1 各组细胞凋亡率比较　（x±s）

XIAP 和Caspase-9 蛋白阳性表达呈棕黄色。 与对照组比较，高氧组和空载体组A549 细胞 XIAP 表达量明显减少，Caspase-9 表达量明显增加 （P<0.05）。XIAP 和Caspase-9 表达水平在高氧组 和空载体组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。 Pin1-shRNA 组细胞XIAP 表达水平明显高于高 氧组和空载体组，但仍低于对照组（P<0.05）； Caspase-9 表达水平低于高氧组和空载体组，但仍 高于对照组（P<0.05）。见图 2、表 2。

图 2 SP 细胞免疫化学方法检测各组细胞中XIAP 和Caspase-9 蛋白的表达（×200）　　XIAP 和Caspase-9 蛋白阳性表达均呈棕黄色。与对照组相比，高氧组和空载体组XIAP 阳性表达减少，Caspase-9 阳性表达增加；Pin1-shRNA 组 XIAP 和Caspase-9 蛋白阳性表达介于对照组和高氧组间。

表 2(Table 2)

表 2 各组XIAP 和Caspase-9 蛋白表达水平比较（x±s）

表 2 各组XIAP 和Caspase-9 蛋白表达水平比较　（x±s）

胞质中ROS 阳性表达呈红色荧光。对照组 ROS 含量最低（1.08±0.05），高氧组（1.47±0.06） 和空载体组（1.48±0.06）ROS 含量显著高于对照 组（分别t=-12.396、-13.402，P<0.05），但两组 间比较差异无统计学意义（t=-0.251，P>0.05）。 Pin1-shRNA 组ROS 含量（1.26±0.04） 较高氧 组和空载体组降低（ 分别t=-7.639、-6.710， P<0.05），但仍高于对照组（t=-7.288，P<0.05）。 见图 3。

图 3 各组细胞线粒体ROS 生成的改变（荧光显微镜，×400）　　线粒体ROS 呈红色荧光，蓝色荧光显示为细胞 核。高氧组、空载体组红色荧光明显增多，代表线粒体ROS 显著高于对照组，而Pin1-shRNA 组线粒体ROS 较高氧组显著降低， 但仍高于对照组。

对照组中线粒体膜电位最高（0.97±0.06）， 而高氧组（0.56±0.03）和空载体组（0.53±0.07） 与之相比均下降（ 分别t=10.661、9.612， P<0.05），但两组间比较差异无统计学意义 （t=0.897，P>0.05）。Pin1-shRNA 组（0.71±0.03） 膜电位高于高氧组和空载体组（分别t=6.622、 2.634，P<0.05），但仍高于对照组（t=7.302， P<0.05）。见图 4。

图 4 各组细胞线粒体膜电位的改变（荧光显微镜，×400）　　正常线粒体膜电位较高，JC-1 呈现红色荧光，线粒 体膜电位下降时，JC-1 呈现绿色荧光。判断线粒体膜电位高低以红、绿荧光的比值来表示。高氧组、空载体组线粒体膜电位 较对照组降低，Pin1-shRNA 组线粒体膜电位较高氧组有所升高，但仍低于对照组。

随着医疗技术的不断发展，早产儿救治的成 活率逐年增加。但在救治过程中，大部分患儿均 吸入不同浓度的氧气，由此造成了急、慢性肺损伤， 后者已经成为了早产儿，尤其是极低出生体重儿 的主要死亡原因^[7,8]。

越来越多的研究者关注高氧诱导肺泡上皮细 胞的损伤机制，重点仍是氧化应激通路。氧化应 激可产生肿瘤坏死因素α（tumor necrosis factor, TNF-α），后者与细胞膜表面受体特异性结合，通 过死亡受体途径介导细胞凋亡^[9]。此外，有研究表 明持续高氧暴露可产生大量ROS，导致Ca2+ 蓄积 并超载，通过线粒体途径介导细胞凋亡，引起线 粒体通透性转换孔开放，从而氧化磷酸化解偶联 与电子传递链下降、线粒体膜电位丧失、细胞色 素C 和凋亡诱导因子释放等^[10]。本课题组前期研 究证实，Omi/ HtrA2 是一种线粒体丝氨酸蛋白酶， 作为凋亡蛋白之一^[11]，正常情况下存在于线粒体 膜膜间隙中，高氧可以诱导线粒体膜通透性改变， 从线粒体膜间隙释放到细胞质中^[12]，可独立地破 坏核内染色质，经过自身酶切转变成活性形式，与XIAP 相互作用，进而激活凋亡蛋白家族的主要 成员Caspase 并作用于其他Ca2+ 依赖性蛋白，通过 这些变化导致整个细胞的结构破坏、功能紊乱， 最终细胞凋亡^[13]。

Pin1 是人类肽基脯氨酰异构酶，能特异地识 别和结合蛋白质磷酸化的丝/ 苏- 脯氨酸基序，催 化磷酸化的丝/ 苏- 脯氨酸肽键发生顺反异构，从 而改变磷酸化蛋白质的功能^{[14, 15]}。目前尚无报道关 于Pin1 参与线粒体氧化应激通路的相关报道。线 粒体作为细胞内唯一供能细胞器，既是细胞产生 氧化应激反应的重要部位，又是发生细胞凋亡的 的中心环节^[16]。本实验研究Pin1 所参与的氧化磷 酸化途径是通过线粒体膜通透性的改变，进入胞 质中活化后的p66Shc 转移到线粒体呼吸链酶复合 体Ⅲ氧化细胞色素C 产生ROS/H₂O₂。当细胞色素 C 等进入胞质中，与d-ATP 结合，激活Apaf-1， Apaf-1 寡聚化使凋亡起始蛋白酶原前体Caspase-9 激活，从而启动了凋亡途径。XIAP 的BIR3 结构 域可与在Asp315 位点酶切活化的Caspase-9 上315 位天冬氨酸能与XIAP-BIR3 结合，产生抑制信号 而阻滞Caspase-9 对下游蛋白激活^{[17, 18, 19, 20]}。如果能够 在早期抑制细胞中Pin1 的表达，就可从根源上减少氧化应激后Pin1 介导的p66shc 在线粒体上转位， 进而阻止线粒体呼吸链复合体Ⅲ氧化细胞色素C 产生的ROS/H₂O₂，最终减少高氧对细胞的损伤。

本研究检测了抑制Pin1 表达后的A549 细 胞系相关指标。在流式细胞仪检测凋亡中，抑制 Pin1 表达的A549 细胞系给予高氧刺激后能够降低 凋亡率；其在免疫组化检测结果中得到，XIAP 的 表达较高氧组有所增加，Caspase-9 的表达有所下 降；在检测线粒体ROS 的产生中，抑制Pin1 表达 的A549 细胞系中表达活性氧簇的红色荧光较高氧 组明显减少；而在检测线粒体膜电位的变化中， 其线粒体膜电位较高氧组高，但未达到对照组水 平。由此可见，Pin1 通过p66shc 调节细胞氧化应 激反应信号通路，抑制其表达有望成为新的氧化 应激治疗方法，提高早产儿的生存质量。