新生儿缺氧性肠道损伤是新生儿窒息的常见 消化系统并发症^[1]，尤其多见于低出生体重儿（low birth weight infant,LBWI）。随着研究的深入，谷 氨酰胺（Glutamine,Gln）因对新生儿特别是LBWI 小肠上皮细胞屏障功能的保护作用和对免疫功能 的调节作用成为新生儿肠道营养研究的新热点之 一。由于Gln 对酸性环境敏感，无法耐受高温消 毒，水溶液中性质不稳定。而丙氨酰- 谷氨酰胺 （L-Alanyl-L-Glutamine,Ala-Gln）作为Gln 载体形 式的二肽，与单纯的Gln 相比，具有水解稳定性， 适合静脉制剂而成为Gln 制剂研究的新选择。Gln 作为“免疫营养素”不仅补充营养物质的缺乏， 更以特定的方式刺激免疫细胞增强免疫应答，维 持正常适度的反应，调控细胞因子的产生和释放， 减轻有害或过度的炎症反应，维持肠屏障功能的 完整，减少感染的发生^[2]。而胰岛素样生长因子-1 （Insulin-like growth factor-1,IGF-1） 作为重要的 胃肠道激素之一，在新生儿消化系统结构和功能 的成熟与完善方面起着非常重要的作用。有研究 发现IGF-1 同样能促进肠上皮细胞生长增殖及免 疫细胞的增殖活化^[3]。目前临床上有关Ala-Gln 及 IGF-1 相关的研究资料尚少，Ala-Gln 通过何种途 径促进小肠黏膜上皮细胞增殖，维持肠道屏障功 能以及与IGF 间的相互作用，特别是当宫内发育 迟缓或LBWI 发生肠损伤时两者是否存在联系等均 不甚明了。

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）目前仍然 是新生儿病死率增加的主要原因，也是导致早产 儿死亡的主要疾病之一。Meyer 等^[4] 通过缺氧- 复 氧和窒息后冷处理的方法成功建立了NEC 动物模 型。柯志勇等^[5] 的实验结果显示被动吸烟法相对 其它方法因为可获取较多活产的仔鼠且宫内发育 迟缓（IUGR）的发病率高（61.6%），而更有利于 儿科实验研究。本实验采用被动吸烟法建立LBW新生大鼠模型并制造缺氧诱导肠道损伤病变，通 过了解IGF-1、IGF-1 受体（IGF-1R）的动态变化， 从而为临床治疗缺氧性肠损伤甚至NEC 时提供一 定的理论依据。 1　材料与方法 1.1　实验动物

15~20 周龄Sprague-Dawley（SD） 大鼠24 只 由中山大学医学院动物中心提供，雌雄比为2 : 1， 动物批号：SCXK（粤）2004-0011。动物于室温、 自然光照条件下自由饮水，标准饲料喂养。 1.2　主要试剂

N(2)-Ala-Gln 注射液由德国费森尤斯公司出 品，含Gln 活性成分13.46 g/100 mL；IGF-1 的 ELISA 试剂盒和兔抗大鼠IGF-1R 多克隆抗体（产 品编号ELI05827） 购于美国R&D 生物公司； SABC 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂购自武汉博 士德生物工程有限公司。 1.3　低出生体重动物模型建立

根据文献^[5]，将发情期SD 雌性大鼠与雄鼠合 笼，次日晨观察阴道涂片，以发现精子为妊娠第1 天，一部分孕鼠正常饲养，获得200 只SD 新生大 鼠并称量体重作为正常体重标准。另一部分孕鼠 于孕10 d 起置于烟雾吸入箱中，每天熏烟4 次， 每次3 支，燃烟时间为10~15 min，两次间隔为 2 h，吸烟至自然分娩。以出生体重小于相同饲养 环境非吸烟条件下正常新生大鼠平均体重2 个标 准差（2 SD<4.916 g）为LBW 新生大鼠标准，共 获得72 只；另选取吸烟条件和非吸烟条件下正常 出生体重的新生大鼠各24 只作为对照。 1.4　实验动物分组

将72 只新生LBW 大鼠遵照随机数字表法分 为低出生体重对照组（C 组）、缺氧- 复氧组（D 组）和Ala-Gln 组（E 组）；非吸烟条件下正常出生体 重新生大鼠设为A 组，吸烟条件下正常出生体重 新生大鼠设为B 组；每组24 只。 1.5　缺氧- 复氧动物模型建立

根据文献^[4]，向特制缺氧舱内通入CO2 气体， 浓度达100% 后，放入D、E 组1 日龄新生LBW 大鼠5 min 后取出，迅速给氧舱通入纯氧使舱内浓 度达100%，再将缺氧后新生大鼠放入舱内5 min 取出，接着置于4℃冷环境中持续10 min，待处 理结束后将两组新生大鼠放回母鼠身边喂养。缺 氧- 复氧操作连续3 d，每天2 次。C 组置于空 气中；E 组在每日缺氧处理前腹腔注射Ala-Gln （10 mL/kg），C、D 组以等量生理盐水行替代注射。 1.6　标本采集及处理

每组于生后第4、7、10 天各取8 只大鼠断头 处死，留取近回盲部1~2 cm 处回肠，置于10% 福 尔马林溶液中固定，制备石蜡切片；其余肠组织 制备肠组织匀浆，3 500 rpm 离心20 min 后，取上 清液置-20℃冰箱待测。 1.7　ELISA 法检测肠组织IGF-1 水平

取各组肠组织匀浆上清液，按ELISA 试剂盒 操作说明书检测各组肠组织中IGF-1 表达水平。 1.8　免疫组化法检测肠组织IGF-1R 水平

将石蜡切片固定、脱蜡，于不同浓度梯度乙 醇液中至水，PBS 浸洗后放入新鲜配置的3%H2O2 溶液中室温孵育10 min，蒸馏水洗后行微波抗原修 复。滴加兔抗大鼠IGF-1R 多克隆抗体一抗（1 : 750）， 4℃孵育过夜，37℃复温30 min 后PBS 冲洗；滴加 生物素化山羊抗兔IgG 二抗，37℃孵育20 min 后 PBS 冲洗；滴加SABC，37℃孵育20 min 后PBS 冲洗。 DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。 每个标本随机选取3 张石蜡切片，将切片置于日 本Nikon Eclipse TE 2000-U 型倒置显微镜下，随机 选取5 个视野，固定窗口面积，利用ACT-2U 图 像采集系统采集信息，应用美国Image-Pro Plus 6.0 软件测定阳性细胞平均光密度值（AOD），结果 取平均值。 1.9　统计学分析

采用SPSS 18.0 统计软件对数据进行统计学分 析。计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，多 组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　各组LBW 新生大鼠肠组织的病理改变

肉眼观察C 组大鼠肠道光滑，无明显变色肿 胀；光镜下观察肠绒毛完整，排列整齐。肉眼观 察D 组出现肠变色、出血、回肠胀气或狭窄等肠 损伤征象；光镜下见绒毛断裂、脱落甚至中重度 坏死，肠壁变薄，局部可见红细胞及淋巴细胞增 多。肉眼观察E 组肠损伤程度较D 组减轻，光镜 下见少量绒毛断裂脱落，部分绒毛呈轻中度坏死。 见图 1。

图 1 各组新生大鼠肠组织病理学变化（苏木精- 伊红染色，×100）　C 组肠绒毛完整，均匀向管腔中心聚集， 肠壁厚度均一。第4 天： D 组肠绒毛断裂，高度降低，数量减少，黏膜层局部淋巴细胞增多；E 组肠绒毛部分断裂，高度降低， 数量减少。第7 天：D 组肠绒毛断裂、脱落，高度和数量明显减少，局部肠壁变薄；E 组肠绒毛断裂、脱落减轻，高度和数 量较D 组增加。第10 天：D 组肠绒毛脱落、缺失，高度和数量减少，肠壁明显变薄；E 组肠绒毛轻度断裂、脱落，高度和数 量较D 组增加。

A 组与B 组体重在各时间点差异无统计学意 义（P>0.05）。C、D、E 组第4 天体重仍明显低 于A 组（P<0.05），第7 天体重差异消失（P>0.05）。 第10 天，C、E 组体重接近A、B 组（P>0.05）， 而D 组体重低于C 组和E 组（P<0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组新生大鼠平均体重变化（x±s）

表 1 各组新生大鼠平均体重变化（x±s）

A、B 组IGF-1 蛋白水平在各时间点差异无统 计学意义（P>0.05）。C 组第4 天和第7 天IGF-1 蛋白水平均高于A 组和B 组（P<0.05），第10 天 差异消失（P>0.05）。D 组各时间点IGF-1 蛋白水 平均明显低于C 组（P<0.05）。E 组第4 天和第7 天IGF-1 蛋白水平低于C 组（P<0.05），而第7 天 和第10 天IGF-1 水平明显高于D 组（P<0.05）。 见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组肠组织IGF-1 蛋白含量比较（x±s,pg/mL）

表 2 各组肠组织IGF-1 蛋白含量比较（x±s,pg/mL）

免疫组化染色显示IGF-1R 蛋白阳性反应产物 呈棕黄色颗粒，多分布于绒毛上皮层和固有层结 缔组织中的吸收细胞和固有层淋巴细胞、浆细胞 胞膜上。IGF-1R 蛋白水平变化与IGF-1 类似，A、 B 组IGF-1R 蛋白水平在各时间点差异无统计学意 义（P>0.05）。C 组第7 天IGF-1R 蛋白水平均高 于A 组和B 组（P<0.05），第10 天差异消失（P>0.05）。 D 组各时间点IGF-1R 蛋白水平均明显低于C 组 （P<0.05）。E 组第4 天和第7 天IGF-1R 蛋白水 平低于C 组（P<0.05），而第10 天IGF-1R 蛋白 水平明显高于D 组（P<0.05）。见表 3、图 2。

表 3(Table 3)

表 3 各组肠组织IGF-1R 平均光密度值比较　（x±s）

表 3 各组肠组织IGF-1R 平均光密度值比较　（x±s）

图 2 各组新生大鼠肠组织IGF-1R 免疫组化染色结果（DAB 显色，×400）IGF-1R 阳性表达呈棕黄色颗粒， 多分布于绒毛上皮层和固有层结缔组织中的吸收细胞和固有层淋巴细胞、浆细胞胞膜上。C 组IGF-1R 表达水平较高，且随时 间推移有增高趋势；D 组IGF-1R 表达水平较C 组降低；E 组第4 天和第7 天的IGF-1R 表达水平与D 组相仿，第10 天明显增多。

吸烟对妊娠有害早为人知，孕妇吸烟发生流 产、胎盘早剥、胎儿宫内发育迟缓及早产的风险 均增高。Magee^[6] 从新生儿出生资料中提取了孕妇 的吸烟率和吸烟量对婴儿出生体重的影响，应用 logistic 回归法将吸烟对LBW 的影响进行单变量分 析，结果发现轻度吸烟（<11 支/d）对LBW 的影 响率高达60%。本实验通过被动吸烟造模法成功 获得LBW 仔鼠，为后期研究打下基础。 有文献表 明被动吸烟不仅与出生体重降低有关，同时可能 降低血清IGF-1 水平，猜测宫内被动吸烟造成胚 胎组织缺氧可能是引起胎儿宫内生长迟缓和血清 IGF-1 下降的一个重要原因^[7]。据此假想，本实验 被动吸烟组和非吸烟组新生鼠IGF-1、IGF-1R 水 平应该存在差异，然而实际情况发现两组正常体 重新生鼠肠组织的IGF-1 与其受体在生后各时间点 差异均无统计学意义，与假设相矛盾。由于现有 文献资料多测量胎鼠或第1 天出生大鼠血清IGF-1 含量，而本实验以测量宫内第10 天开始至出生时 被动吸烟的新生鼠在生后第4 天以后的IGF-1 含量为检测指标，确有存在与文献不一致的可能。推 测原因也可能是同被动吸烟时间较短有关，确切 机制还有待进一步研究。

脐血清IGF-1 与胎龄、胎盘重量呈显著正相 关，其中与胎盘重量呈高度正相关，与胎儿体重 是否有相关关系，目前尚存在争论^{[8, 9]}。多数研究 表明，无论是人类还是动物模型，大多支持LBW 与IGF-1 含量下降有关，认为IGF-1 对哺乳动物胚 胎期及生后的生长发育起重要作用。同时宫内生 长迟缓患儿生后可出现追赶生长，IGF-1 能加速分 泌，帮助其体重和身长的恢复。本实验中LBW 对 照组肠组织IGF-1 和IGF-1R 蛋白含量呈上升趋势， 第7 天前明显高于其他各组，其中非吸烟/ 吸烟正 常体重组和低出生体重对照组第7 天蛋白含量差 异均有统计学意义，第10 天差异消失。不过出现 生长追赶和消失的时间差异较大，可能与检测时 间点的选择及IGF-1 检测途径有关，不排除肠道 IGFs 的变化较血清中变化及时和对生长追赶反应 更灵敏的可能性。

Zhou 等^[10] 研究发现Gln 是通过下调TLR-2 和 TLR-4 的水平来保护发生NEC 的新生鼠肠道。对患有NEC 的新生儿血浆氨基酸水平测定表明，患 儿有明显的Gln 缺乏，提示Gln 缺乏可能是NEC 的易感因素之一^[11]。由于Gln 对酸性环境敏感， 无法耐受高温消毒，水溶液中性质不稳定，既往 无论动物实验还是临床研究多以胃肠道内添加为 主，特别是有关新生儿临床应用的资料不多。大 多数研究是以占氨基酸总量的一个固定百分比 （15%~35%）投予。一般认为成年人术后对蛋白 质的需求量为每日1.5 g/kg，Gln 剂量通常为每日 0.3 g/kg，而新生儿一般为每日0.2 g/kg，但对于处 于应激状态的病人，特别是早产儿，蛋白质需要量 增加，需要更多的外源性谷氨酰胺补给，但确切的 剂量尚未确定。Ala-Gln 作为Gln 载体形式的二肽， 与单纯的Gln 相比，具有水解稳定性，适合静脉制 剂而成为Gln 制剂研究的新选择。本实验参考李军 等^[12] 动物实验中Gln 溶液（10 mL/kg，活性成分 1.346 g/kg）剂量对新生鼠腹腔注射Ala-Gln，发现 可减轻LBW 新生鼠缺氧肠损伤程度，而且肠组织 IGF-1 及IGF-1R 蛋白含量在生后第10 天明显高于 缺氧- 复氧组，提示Ala-Gln 和IGFs 在维护肠屏 障结构和功能完整性方面存在一定联系。猜测可能 的机制是与两者都可上调小肠黏膜上皮细胞C-Fos 和C-Jun 基因的表达有关，并通过刺激IGF-1 表达 促进肠上皮细胞增殖。

总之，Ala-Gln 对缺氧后肠损伤有保护作用， 为新生儿NEC 的防治提供了一定的理论依据。然 而，Ala-Gln 与IGF-1 系统在缺氧后肠损伤中的具 体作用和确切机制有待进一步研究。