偏头痛被认为是一种中枢神经和血管发生 某些功能障碍而导致的疾病，表现为单侧或双侧 头痛，有搏动性，以反复发作性头痛为主要症 状^{[1, 2]}。病因和发病机制尚未完全明确，主要的发 作机制依赖于血管源性学说，皮层扩散性抑制学 说等^[3]，目前三叉神经血管学说日益受到广大学 者的关注。瞬时受体电位通道家族M8（transient receptor potential melastatin 8 channels,TRPM8） 亚型在三叉神经血管中起着重要的作用^[4]，亦有 TRPM8 参与偏头痛发作的研究^{[5, 6]}。谷氨酸受体 （NMDAR）能解除Mg2+ 对Ca2+ 内流的抑制，使 Ca2+ 大量进入神经元内，从而出现钙超载，并触 发细胞内钙敏感性的信号级联，促进蛋白激酶A （PKA）的激活^[7]，导致细胞膜蛋白受体TRPM8 表达上调。本研究拟通过动物实验来探讨TRPM8 在偏头痛发病机制中的作用。 1　材料与方法 1.1　实验动物

清洁级健康雄性Sprague-Dawley（SD） 大 鼠20 只由四川省医学科学院/ 四川省人民医院动 物实验中心提供，合格许可证号：SYXK（川） 2008-110，平均体重180~200 g，鼠龄2~3 个月。 1.2　实验器材

显微镜（日本Nikon 公司）；精密天平分析 仪（Sartorius 公司）；微量移液器（法国Gilson 公 司）；荧光显微镜（日本Nikon 公司）；电泳仪、 电泳槽和转膜系统（美国Bio-Rad 公司）。 1.3　实验试剂

硝酸甘油注射液（北京益民药业有限公司）， NMDAR 抗体（北京博奥森公司），PKA 抗体（英 国Abcam 公司），TRPM8 抗体（英国Abcam 公司）， 10% 水合氯醛（天津市瑞金物化学品有限公司）， 细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（江苏碧云 天生物有限公司），四甲基乙二胺（TEMED）（美 国Sigma 公司）。 1.4　硝酸甘油偏头痛模型建立及行为学观察

将20 只大鼠进行编号，按随机数字表法随 机分为模型组和空白对照组，每组10 只。模型组 依照Tassorelli 法^[8] 建立无先兆偏头痛大鼠模型： 在颈背部每周1 次皮下注射硝酸甘油，每次剂量均为10 mg/kg，共5 周。空白对照组用等量生理盐 水代替硝酸甘油行颈背部皮下注射，共5 周，分 笼普通喂养。注入了硝酸甘油的大鼠，在数分钟 后则出现耳朵发红，烦躁不安，两前肢高频率搔 头，攀爬鼠笼的次数显著增加，这些现象约1~2 h 后消失，然后大鼠表现出困倦、闭眼、不活动等状 态^[9]；出现上述表现后，按照下列标准予以评分^[10]： （1）梳理毛发行动：10 次评为1 分（之后每出现 1 次加0.1 分），（2）围着铁笼来回打转：2 次评 为1 分（之后每出现1 次加1 分），（3）攀爬笼子： 3 次评为1 分（之后每出现1 次加1 分），（4）烦 躁：往返运动1 次计1 分，（5）咬尾：1 次计1 分， （6）耳朵发红：出现则为1 分，以30 min 为一个 观察时间段，对每只受试大鼠的以上行为做评分 记录，总分达6 分及6 分以上者则视为造模成功。 1.5　标本采集及处理

两组大鼠于行为学评分后用10% 水合氯醛 （3.5 mL/kg）麻醉，固定于手术台上，打开胸腔， 剥离心包，暴露心脏，输液头皮针头从心尖搏动 处插到升主动脉，止血钳固定针头，快速注入生 理盐水约150 mL 直到大鼠肝脏、肺、胸壁血管及 四肢逐渐变苍白，再将50 mL 4% 多聚甲醛先快后 慢注入其中一部分大鼠体内，直到大鼠尾巴变硬 则停止灌注，大鼠俯卧于手术台上，暴露并剥去 颅骨，暴露大脑，去除其表面的硬脑膜，将大脑 组织整体翻起，暴露颅底的三叉神经节，将三叉 神经节完整剥离并剪断，剥去其表面的硬脑膜， 放入4% 多聚甲醛中固定，4℃保存；另一部分大 鼠麻醉灌注后直接开颅取颅底三叉神经节，并迅 速放于液氮中保存，备用。 1.6　免疫组化法检测NMDAR 表达

将三叉神经节标本放入不同浓度梯度乙醇中 脱水至沉底、透明，石蜡包埋，行5 μm 厚度冠状 切片。切片经脱蜡、水化，封闭内源性过氧化物酶 及微波抗原修复后，滴加山羊血清封闭液（1 : 200）， 室温孵育20 min 后，用吸水纸吸去封闭液；滴加 兔抗大鼠一抗（NMDAR 抗体，1 : 200），37℃下 放置1 h 后放入4℃冰箱过夜或37℃下放置2 h 以 上，PBS 洗3 次，每次5 min；再滴加生物素羊抗 兔二抗（1 : 200），37℃放置0.5~1 h，PBS 洗3 次， 每次5 min；最后滴加约50 μL 辣根过氧化物酶标 记的链亲和素，37℃放置0.5~1 h，PBS 洗3 次，每次5 min。DAB 显色，苏木素复染，盐酸酒精 分色，氨水返蓝，脱水、透明，中性树胶封片。 每个标本随机选取20 张切片，每张切片在400 倍 光镜下随机选取10 个视野进行观察，采用Image- Pro Plus 6.0图像分析系统对每一张切片进行分析， 以NMDAR 阳性细胞的平均光密度（OD）来表示 NMDAR 表达水平。 1.7　免疫荧光检测PKA 蛋白表达

取上述抗原修复后切片，滴加山羊血清封闭 液（1 : 100），室温孵育30 min 后倾去多余液体， 不洗；滴加1%BSA 稀释的兔抗大鼠一抗（PKA 抗体， 1 : 100），37℃下放置1 h 后放入4℃冰箱过夜或 37℃下放置2 h 以上，PBS 洗3 次，每次5 min； 再滴加荧光标记的山羊抗兔二抗（1 : 100），避光， 37℃孵育30 min，PBS 洗3 次，每次5 min；最后 用5 μg/mL DAPI 对细胞核染色，抗荧光淬灭制剂 封片。每个标本随机选取20 张切片，每张切片在 100 倍光镜下随机选取10 个视野进行观察，采用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统对每张切片进行图 像采集和分析，以PKA 阳性细胞的OD 值来表示 PKA 表达水平。 1.8　Western blot 检测TRPM8 表达

将液氮中储存的三叉神经节标本取出并撵碎 （每5 min 加入液氮1 次），预冷的PBS 洗涤， 加入10 μL/100 mg 组织蛋白裂解液和1 mL/100 mg 的PMSF，分装于EP 管中，并置于冰浴中 20~30 min 使蛋白充分裂解，震荡仪震荡混匀。 4℃ 11 000 rpm 离心10~20 min，将上清液分装于0.5 mL EP 管中，行SDS-PAGE 蛋白电泳，转膜（湿转法）， 封闭，抗原抗体反应及显色。采用Quantity One 图 像分析软件测量条带的光密度值，以靶蛋白灰度/β-actin 灰度比值表示TRPM8 的相对表达量。实 验重复3 次。 1.9　统计学分析

采用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析 处理，符合正态分布的计量资料以均数± 标准差 （x±s）表示，两组间均数的比较采用t 检验；相 关性分析采用Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有 统计学意义。 2　结果 2.1　两组大鼠行为学评分结果

与对照组比较，每周模型组大鼠行为学评分 均明显升高（P<0.05），且均高于6 分，提示造模 成功，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两组大鼠行为学评分比较（x±s）

表 1 两组大鼠行为学评分比较（x±s）

NMDAR 阳性表达呈棕黄色。对照组中神经细 胞NMDAR 表达较弱，模型组神经细胞中NMDAR 呈强阳性表达（图 1）。通过分析显示模型组 NMDAR 表达水平（0.420±0.033）明显高于对照 组（0.120±0.015）（t=242.355，P<0.01）。

图 1 　免疫组化法检测两组大鼠三叉神经组织中 NMDAR 的表达（DAB 显色，×400）　NMDAR 表达于细胞 膜和细胞质中，其阳性表达呈棕黄色。对照组中神经细胞NMDAR 表达较弱，模型组神经细胞中NMDAR 呈强阳性表达。

PKA 蛋白表达呈绿色荧光。对照组中神经细 胞PKA 蛋白表达较弱（0.160±0.034），模型组神 经细胞中PKA 蛋白呈强阳性表达（0.410±0.057）， 与对照组比较差异有统计学意义（t=83.104， P<0.01），见图 2。

图 2 免疫荧光法检测两组大鼠三叉神经组织中PKA 蛋白的表达（DAPI，×400）　PKA 蛋白表达于细胞膜和细胞 质中，绿色荧光为PKA 的阳性表达。对照组中神经细胞PKA 蛋 白表达较弱，模型组神经细胞中PKA 蛋白呈强阳性表达。

Western blot 检测结果显示模型组TRPM8 表 达水平（149±14）高于对照组（62±8）（t=560.93， P<0.01），见图 3。

图 3 Western blot 检测两组大鼠三叉神经组织中 TRPM8 的表达

模型组大鼠行为学评分与TRPM8 水平之间呈 正相关（r=0.822，P<0.01），说明TRPM8 的表达 水平越高，行为学评分越高，症状越典型，提示 TRPM8 可能参与了偏头痛的发病机制。 2.6　模型组NMDAR 与TRPM8 的相关性分析

模型组大鼠三叉神经组织中NMDAR 水平与 TRPM8 水平之间呈正相关（r=0.794，P<0.01）， 说明NMDAR 表达增加，TRPM8 表达亦增加，提 示NMDAR 可能与TRPM8 共同参与了偏头痛的发 病机制。 3　讨论

偏头痛是一种血管和/ 或神经功能紊乱性反 复发作性慢性疾病，有些还伴有畏光、声音恐惧、 恶心、呕吐、腹痛等症状。近年来，偏头痛发病 率有逐年上升的趋势，而且伴随年龄趋于年轻化， 该病严重影响了患者的学习和日常生活，其中儿 童偏头痛发作的特点：（1）大多数偏头痛患儿具 有家族遗传史^[11]；（2）发作时间较短，常常持续 时间为2~48 h，少数持续仅约1 h；（3）发生部 位以额部最为好发，其次是一侧或双侧额颞部^[12]； （4）女性患者疾病发作可能与雌二醇有极大的关 系，常常在妊娠期停止发作或发作次数明显减少， 周期缩短^[13]；（5）搏动性及中、重度头痛不明显。

对年龄较大的儿童偏头痛患者而言，常见的 先兆症状为眼前出现瞬间的强光束、一侧视觉消 失、眼前闪现金星或各种形态的黑点，往往发生 在头痛前半小时，然而有先兆偏头痛只占很少部 分。无先兆偏头痛占70%~85%，发作时患儿常寻 找一个安静、光线暗淡的地方躺下，避免声音和 光线刺激，易受外界环境或者学习压力而反复发 作，因此也是本次实验研究观察的要点。

然而，偏头痛的发作机理还不完全清楚，目 前公认的机理主要依赖于三种学说：即神经源性、 血管源性和三叉神经血管学说^[14]。目前，三叉神 经血管学说作为主流学说受到广大学者们的关注， 该学说是将血管源性和神经源性学说融入一体： 中枢血管强烈扩张，神经炎性递质的大量释放， 使三叉神经受内部和外部因素刺激，神经递质产 生，将痛觉信号沿三叉神经传导至三叉神经脊束 核，再经过脑干前端、丘脑传入皮层，使大脑皮 层产生炎症反应^[15]。最终导致偏头痛发生，很好 的诠释了偏头痛的发生和发展。

在此研究中，考虑到临床儿童偏头痛多为无 先兆偏头痛，以此为研究出发点，所以建立无先 兆硝酸甘油偏头痛大鼠模型。该模型支持三叉神 经血管学说：由于NTG 释放出的NO 通过血脑屏 障激活了血管周围的三叉神经末梢，释放神经肽， 使脑膜血管过度紧张，血浆蛋白渗出，肥大细胞 脱颗粒，从而导致脑膜神经血管系统产生神经性 炎症^[16]，这种伤害性刺激沿着三叉神经传入纤维传至三叉神经核尾部，冲动达到延脑化学感受器， 引起恶心、呕吐；传入下丘脑，出现畏光；传入 大脑皮层产生疼痛^[17]。这再一次验证了以往学者 研究的三叉神经血管理论具有真实性和可重复性， 故本研究认为三叉神经节是偏头痛发生发展的重 要枢纽。

本实验研究在偏头痛动物模型制作成功后， TRPM8 表达水平较对照组明显升高，说明TRPM8 可能参与了偏头痛的发生和发展过程。但TRPM8 表达的增加也会导致冷痛觉过敏^[18]。TRPM8 参与 慢性疼痛的机制中，主要是炎症组织中蛋白激酶 和磷酸激酶的激活，导致细胞膜蛋白受体TRPM8 表达上调，通道开放阈值下降，突触严重受损， 对疼痛感应部位产生痛觉过敏和超敏^[19]。故偏头 痛大鼠三叉神经节中TRPM8 蛋白表达是上调的， 这与以往的其他研究结果一致。

NMDAR 可以通过条件性钙离子内流调节突 触传导、突触可塑性和神经细胞变性^[20]。本实验 通过建立硝酸甘油偏头痛大鼠模型的结果显示： NMDAR 表达上调能使PKA 激活，PKA 膜转位促 使NMDAR 磷酸化，两者之间的恶性循环导致偏头 痛的发生与发展，更说明NMDAR 的调节在偏头痛 发作中发挥着不可或缺的作用^[21]。而TRPM8 的激 活主要依赖PKA 的激活^[7]，然而，本研究通过对 NMDAR 与TRPM8 表达水平相关性分析得出结论： NMDAR 与TRPM8 灰度值之间呈正相关，提示 NMDAR 表达增加，TRPM8 表达亦增加，再一次 验证了在偏头痛发作中，TRPM8 升高与NMDAR 表达密切相关^[5]，而PKA 可能作为NMDAR 与 TRPM8 之间的桥梁，共同参与偏头痛的发作。然 而，能否证明TRPM8 参与偏头痛发作机制，它将 通过怎样的途径发挥调节作用，还需加大样本量， 作进一步考察。