流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae,Hi） 是引起儿童细菌性结膜炎、结膜炎 - 耳炎症候群、 细菌性鼻窦炎、下呼吸道感染的常见病原菌 ^[1]。在 常规接种 Hib 联合疫苗前，Hib 是侵入性 Hi 的主 要亚型和 5 岁以下儿童细菌性脑膜炎的最常见病 因 ^[2]，严重感染可以导致患儿致残或死亡。文献报 道，自 20 年前 Hib 结合疫苗问世以来 Hib 感染迅 速下降，且几乎没有出现能取代 Hib 重要位置的 其他亚群感染 ^{[1, 3]}。随着 Hib 感染的下降，全球范 围内对 Hi 的关注程度也随之降低，每千篇病原学 文章中与 Hi 相关文章比例从 1991 年的 18.4‰降 至 2009 年的 7‰ ^[4]。实际上，不可分型流感嗜血 杆 菌（non-typeable Haemophilus influenzae,NTHi） 可能正在悄然取代 Hib 成为重要的儿童呼吸道感 染病原菌，但并未得到应有的关注 ^[1]。本课题组 前期在一项针对儿童下呼吸道感染病原菌的研究 中发现 Hi 在 2001~2006 年成都地区儿童下呼吸 道感染病原菌中排列第一，占下呼吸道感染病原 菌的 21%^[5]。同期分子分型研究发现其中 NTHi 占 99.6%^{[6, 7, 8]}。既往国内对儿童 Hi 感染临床流行病学 背景以及同一地区、长时间跨度的病原菌耐药动 态少有系统报道。为追踪同一地区近两年 0~17 岁 住院患儿 Hi 阳性分离者的基本临床流行病学特 征及 β- 内酰胺酶阴性氨苄西林耐药（β-lactamasenonproducing-ampicillin-resistant,BLNAR）和含有多 重耐药机制的 β- 内酰胺酶阳性阿莫西林克拉维酸 耐 药（β-lactamase-producing-amoxicilli/clavulanateresistant,BLPACR）菌株等耐药动态，本课题组以 本地区一家综合性三甲医院为研究现场进行回顾 性断面调查，现报告如下。 1　资料与方法 1.1　研究对象

以成都市第三人民医院住院患儿痰液或咽拭 子标本 Hi 分离阳性者为研究对象进行回顾性断面 调查。 1.2　数据库建立

进入医院微生物室信息系统，以 Hi 为关键词 检 索 2011 年 6 月 1 日 至 2013 年 5 月 31 日 0~17 岁住院患儿痰液或咽拭子标本 Hi 分离阳性住院患儿的基本信息，查阅电子病历并建立数据库。儿 科疾病诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》 ^[9]，儿 童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）诊断标准和分度标准采用中华医学会儿科学 分会呼吸学组 2013 年修订的“儿童社区获得性肺 炎管理指南（2013 修订）” ^[10] 标准。 1.3　标本采集

痰液采集通过一次性鼻导管或气管插管负 压吸取痰液；咽拭子采集方法为左手用压舌板压 住患儿舌头，待患儿发“啊 -”音时，右手持无 菌拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（避免触及舌 部），将拭子头浸入采集液中。痰液和咽拭子采 样合格标准为：涂片细胞学检查显示中性粒细胞 >25 个 / 低 倍 视 野（×100 倍），鳞 状 上 皮 细 胞 <10 个 / 低倍视野（×100 倍），或白细胞 / 鳞状 上皮细胞≥ 10^[11]。 1.4　流感嗜血杆菌培养和鉴定

操作严格按照“全国临床检验操作规程”第 2 版进行。将质控合格的痰及咽拭子标本常规接种 于哥伦比亚血琼脂平板、嗜血杆菌巧克力平板及 麦康凯平板，血平板培养基为 5% 脱纤维绵羊血； 嗜血杆菌巧克力平板另加2.5 U/mL去甲万古霉素。 挑取嗜血杆菌巧克力平板上湿润、光滑、易乳化 的菌落，用 V 因子、X 因子及 V+X 因子纸片行 Hi 初筛实验，再用 NH 鉴定卡进一步鉴定。培养基及 因子纸片均购自英国 OXOID 公司，NH 鉴定卡购 自美国 Thermo Scientific 公司。 1.5　药物敏感试验

用法国生物梅里埃 ATB 药敏卡进行药敏试验。 用 ATCC49247 Hi 标准菌株进行质控，标准菌株购 自卫生部临检中心，药敏结果判断依据美国临床 实验室标准化研究所（CLSI）2012 年标准执行 ^[12]。 1.6　 β- 内酰胺酶测定

用英国 OXOID 公司提供的头孢硝基噻吩显色 反应法检测。 1.7　统计学分析

采用 SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，计 数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用 χ² 检验或 Fisher 确切概率法，P<0.05 为差异有统 计学意义。 2　结果 2.1　基本情况

2011 年 6 月至 2013 年 5 月 0~17 岁住院患儿 送检痰液和咽拭子标本分离出 Hi 117 株，排除同 一患儿同一时段和不同时段采集多份标本分离出 的 Hi 菌株 6 株，Hi 分离阳性患儿共 111 例纳入调 查，男 63 例，女 48 例。年龄段分布：0~28 d 7 例 （6.3%），29 d~1 岁 32 例（28.8%），2~3 岁 37 例（33.3%），4~6 岁 25 例（22.5%），7~17 岁 10 例（9.0%）。时间分布：1~12 月分别为 12 例、 2 例、12 例、10 例、22 例、10 例、5 例、3 例、4 例、7 例、18 例和 6 例，时间分布趋势见图 1，纳 入调查的 24 个月均有 Hi 检出，两个年度的共同 检出高峰均在 5 月和 11 月。

图 1　Hi 阳性检出月份分布

117 株 Hi 中痰液分离 87 株（74.4%），咽拭 子 30 株（25.6%），不同疾病病原学送检情况及 Hi 阳性检出情况见表 1。111 例 Hi 阳性患儿中呼吸道感染性疾病 102 例（91.9%），其他疾病 9 例 （8.1%）。其中以支气管肺炎及肺炎患儿 Hi 检出 率最高，急性喉气管支气管炎阳检率次之，其他 依次为毛细支气管炎、急性支气管炎、喘息性支 气管炎、疱疹性咽峡炎、急性上呼吸道感染、急 性扁桃体炎等，新生儿肺炎检出率最低。上述疾 病患儿出院总数为 622 例，病原学检查 511 例， 病原学送检率 82.2%，Hi 总阳检率 21.7%。本组未 发现脑膜炎病例，肺炎患儿 Hi 检出率达到 51%， 27 例 CAP 中 10 例重症肺炎均存在不同程度的意 识障碍和呼吸困难，2 例患儿出现呼吸衰竭，全部 患儿胸片均显示不同程度的肺浸润表现。

表 1(Table 1)

表 1 主要诊断与 Hi 阳检率

表 1 主要诊断与 Hi 阳检率

患儿基础疾病和主要合并症见表 2，常见基 础疾病依次为支气管哮喘或咳嗽变异性哮喘、先 天性心脏病，常见合并症依次为腹泻病、中耳炎、化脓性腮腺炎、鼻窦炎、结膜炎等。分别有 1 例 合并胸膜炎，1 例合并新生儿败血症，5 例患儿从 痰液或咽拭子中分离出其他病原菌，包括肺炎链 球菌 3 例，金黄色葡萄球菌 2 例。全部患儿治愈或好转出院，无一例死亡。

表 2(Table 2)

表 2 患儿基础疾病与主要合并症　（n=111）

表 2 患儿基础疾病与主要合并症　（n=111）

Hi 阳性检出者中剔除药敏试验结果不全 6 例， 共 105 例纳入统计分析。第一年度 Hi 产 β- 内酰 胺酶的产酶率为 44%（n=52），第二年度为 42% （n=53），两年间比较差异无统计学意义（χ²=0.079， P=0.778）。两年间 Hi 菌株耐药率比较见表 3，除 阿莫西林克拉维酸（P=0.010）和氯霉素（P=0.015） 外，余差异无统计学意义。β- 内酰胺酶阴性氨 苄西林耐药菌株（BLNAR）和 β- 内酰胺酶阳性 阿莫西林克拉维酸耐药菌株（BLPACR）两年间 均有增长，分别从 12% 增加到 21%，13% 增加到 19%，但差异未显示出统计学意义，见表 4。

表 3(Table 3)

表 3 Hi 菌株耐药率　[n（％）]

表 3 Hi 菌株耐药率　[n（％）]

表 4(Table 4)

表 4 　Hi 菌株耐药表型变化[n（％）]

表 4 　Hi 菌株耐药表型变化[n（％）]

近 20 年来，多个国家的监测数据显示 NTHi 侵入性感染发生率因年龄不同和地域不同有所差 异。 美 国 1989 年 Hi 侵 入 性 感 染 80% 为 Hib、 17% 为 NTHi 导 致，2008 年 3% 为 Hib、68% 为 NTHi；1999~2008 年间 NTHi 年发生率是 0.99/10 万， 发生率最高是 1 岁内婴儿（5.87/10 万）和 >65 岁 的 成 人（4.09/10 万） ^[13]。1992~2006 年，14 个 将 Hi 常规进行血清型鉴定的国家监测数据显示与上 年同比侵入性非 Hib 型感染性疾病上升 3.5% 且主 要由 NTHi 引起，NTHi 感染占 97%^[14]。确诊下呼吸道感染病原菌标本目前公认最可靠的方法是经 胸廓细针穿刺活检，但临床上并不被常规采用， 因此，通常采用其他非直接诊断标本采样，如血液、 痰液和支气管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage, BAL）培养 ^[1]。研究认为尽管下呼吸道感染患儿痰 和 BAL 培养常被鼻咽部微生物污染，但此类标本 按标准流程收集仍能够提供有价值的下呼吸道微 生物定植的信息 ^{[15, 16]}。20%~94% 的 CAP 患儿合格 痰液标本和 BAL 中被检出 NTHi^{[17, 18, 19]}。过去认为会 厌炎是特有的侵入性 Hib 疾病 ^[1]，本组病例未见会 厌炎诊断病例，但 4 例急性喉气管支气管炎住院 患儿中 2 例检出 Hi，患儿存在不同程度的喉梗阻，是否属于 Hi 侵入性感染尚需在前瞻性研究中进一 步证实。值得注意的是，本研究有 7 例新生儿患儿， 其中高胆红素血症合并败血症 1 例未得到血培养 证实，另 1 例重症肺炎合并心肌损害和脑病患儿 临床经过险恶。国外文献报道新生儿 NTHi 侵入性 感染发生率为 1.6~4.9/1 000 活产婴 ^{[20, 21, 22]}，多数新生 儿 NTHi 侵入性感染病例缺乏典型表现，病情进展 迅猛并伴随着高病死率，早产儿暴发病例通常在 24 h 内死亡。因此新生儿 Hi 感染应引起临床医师 高度警惕。

NTHi 气道定植是引起气道感染和组织损伤的 主要病因 ^[23]，国外文献报道顽固的细菌性支气管 炎在 <5 岁的儿童常见，以慢性咳嗽为特征且临床 难以辨别 ^{[24, 25]}，而顽固性细菌性支气管炎患儿痰 液 Hi 阳性检出率达到 81%^[26]。本研究中毛细支气 管炎、急性支气管炎和喘息性支气管炎住院患儿 Hi 阳性占有相当的比例，是否属于继发或原发性 细菌性支气管炎尚需进一步研究证实。NTHi 是引 起慢性化脓性中耳炎、鼻窦炎的重要原因，也是 儿童细菌性结膜炎和结膜炎耳炎症候群的常见病 原菌 ^{[27, 28]}，本研究中呼吸系统感染合并中耳炎、 鼻窦炎、结膜炎仅各 1 例，诊断率偏低，推测与 我国儿童呼吸道感染患儿未常规进行耳镜检查导 致中耳炎和鼻窦炎临床诊断率低有关。

β- 内酰胺酶仍然是 Hi 耐 β- 内酰胺类药物的 主要机制，过去 10 年中全球大多数地区菌株 β- 内 酰胺酶阳性率在 10%~25% 之间，而部分亚洲国家 和地区则达到 55%^[1]。本研究中产 β- 内酰胺酶 Hi 菌株较本课题组 2004~2006 年报道的 40.2% 略有 增加 ^[5]；氨苄西林耐药率较上一调查年度有所上 升，与 2004~2006 年间同地区的 40.6% 相比增长 了 21.66%^[5]；除头孢噻肟耐药率持续保持在较低水 平并较 2004~2006 年间同一地区的 12.5% 下降近 1 倍外，头孢呋辛和头孢克洛耐药率两年间差异无 统计学意义 ^[5]，上述 β- 内酰胺类耐药率的变化与 产 β- 内酰胺酶菌株的变化不完全保持一致，菌株 耐药机制的变化尚待进一步的前瞻性研究证实。

1984 年 前 全 球 未 分 离 到 BLNAR 和 对 β- 内 酰 胺 类 药 物 耐 药 的 非 β- 内 酰 胺 酶 依 赖 性 中 介 （BLNAI）菌株，1990 年代 BLNAR 开始小幅上升， 但 2000 年以后 BLNAR 和 BLNAI 菌株在不同国家 和地区快速增长 ^[1]。本研究中 BLNAR 从上一年度的 12% 增长至 21%，明显高于 2010 年杭州 1.32% 和厦门 2.99% 的增长幅度 ^{[29, 30]}，也略高于 Ito 等 ^[31] 报道 2007 年日本 NTHi 菌株的 17.6%。BLNAR 基 因型对多种抗菌素耐药，其耐药机制主要是青霉 素结合蛋白改变致 β- 内酰胺类抗菌素与其结合能 力降低以及外膜蛋白通透性改变致抗菌药物进入 菌体内减少导致耐药发生 ^[32]。多重耐药机制菌株 BLPACR 的出现和蔓延与 BLNAR 及 BLNAI 类似， 由于 BLPACR 除存在 β- 内酰胺酶耐药机制外，尚 存在与 BLNAR 类似的 PBPs 基因突变。本研究中 BLPACR 菌株从上一年度的 13% 增长至 19%。由 于 BLPACR 菌株对阿莫西林克拉维酸以及其他常 用口服抗菌药物有更高的耐药率，BLPACR 菌株的 增长将导致更加严峻的临床问题。各本地区临床 抗生素监管或抗生素的调整使用，菌株耐药基因 突变等都是影响 BLNAR 和 BLPACR 变化趋势的关 键因素，两者均呈现增长趋势使相应抗菌素敏感 率降低值得持续监测和进一步探讨。

综上，Hi 在 0~17 岁儿童呼吸道感染性疾病 中扮演着重要角色，BLNAR 和 BLPACR 呈现增长 趋势将使临床面临更加严峻的抗生素选择压力。