支气管哮喘（简称哮喘）是一种以慢性气道 炎症为特征的异质性疾病，具有喘息、气促、胸 闷和咳嗽的呼吸道症状病史，伴有可变的呼气气 流受限，呼吸道症状和强度可随时间而变化。近 年来儿童的发病率逐年增高，严重威胁着儿童的 身体健康，我国哮喘病死率位居全球第一，造成 了巨大的社会负担。因此，哮喘的发病机制及其 治疗的研究已成为世界各国学者的研究热点。哮 喘的发病机制极其复杂，尚有许多机制仍不是很 清楚。近来越来越多的研究发现，瘦素在肥胖、 II 型糖尿病、冠心病和癌症等许多领域已经被研 究和重视，在呼吸系统疾病包括哮喘的发病中的 作用也越来越受到重视 ^[1]。国外研究证明在小鼠和 人的肺泡及支气管上皮细胞表面，肺组织内被激 活的淋巴细胞和肥大细胞表面均有瘦素受体的表 达 ^{[2, 3, 4, 5]}。但在不同严重程度哮喘肺组织中瘦素及其 受体的表达情况变化研究甚少，因此本研究采用 Western blot、免疫组化方法和实时荧光定量 PCR （Real-time PCR）法，定量分析不同严重程度的哮 喘小鼠肺组织中瘦素及其受体的蛋白和 mRNA 的 表达，为研究瘦素与哮喘的发病机制的关系奠定 基础，从分子和基因水平探讨哮喘的发病机制开 辟一个新的途径。糖皮质激素作为哮喘的一线用 药，具有强的抗炎作用。但其对哮喘小鼠肺组织 中的瘦素及其受体是否也有一定的影响还存在争 议，因此本研究用布地奈德吸入治疗干预哮喘小 鼠，进一步探讨布地奈德对瘦素及其受体的影响。 1　材料与方法 1.1　材料

卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）、氢氧化铝干 粉（Sigma，美国），兔抗小鼠瘦素及兔抗小鼠瘦 素受体 /OB-Rb 多克隆抗体（北京博奥森生物技 术有限公司），SP 免疫组化染色试剂盒及浓缩型 DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）， TRIzol RNA 抽提液、反转录试剂盒、扩增试剂盒、 瘦素及其受体 OB-Rb 基因引物（宝生物工程有限 公司），RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂 盒（上海碧云天生物技术公司）。 1.2　动物分组及哮喘模型制作

40 只 4~6 周 龄 的 BALB/c 雄 性 小 鼠，体 重18~20 g，购买并饲养于中国医科大学附属盛京医 院实验动物中心 SPF 动物房。按随机数字表法分 为对照组、诱喘 3 d 组、诱喘 7 d 组和布地奈德干 预组，每组 10 只。参考国内外文献制备模型的优 化方案 ^{[6, 7]}，并加以改良，以 OVA 致敏和激发的方 法建立哮喘模型：实验组在实验的第 0、7、14 天 给予 10 μg OVA+1 mg AI(OH)₃+0.4 mL 生理盐水混 悬液腹腔注射致敏；第 21~23 天给予 1%OVA 雾 化激发建立诱喘 3 d 哮喘模型组，第 21~27 天给予 1%OVA 雾化激发建立诱喘 7 d 哮喘模型组，每日 1 次，每次 30 min。布地奈德干预组在诱喘 7 d 小 鼠每次激发前 1 h 雾化吸入布地奈德混悬液 2 mL 进行干预；对照组不给予任何处理；末次激发后 24 h 内取材。 1.3　标本收集

5% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，固定，心尖 取血致死，开胸取新鲜双肺组织，将左肺以 10 倍 体积的 4% 多聚甲醛溶液固定，常规方法石蜡包 埋、切片，行苏木精 - 伊红（HE）染色及免疫组 织化学检测，右肺 -80℃保存用于 Western blot 法 及 Real-time PCR 法分析。 1.4　肺组织 HE 染色

常规二甲苯脱蜡及酒精复水，然后苏木素染 色、冲洗、伊红染色，最后梯度酒精脱水、二甲 苯透明及中性树胶封片。 1.5　免疫组化法检测肺组织中瘦素及瘦素受体蛋白表达

免疫组化步骤按说明书进行。每个样本随机 选取 10 张切片，切片常规脱蜡水化，3% H₂O2 行 抗原修复 30 min，山羊血清封闭 30 min，加入以 1 : 320 稀释的兔抗小鼠瘦素及瘦素受体一抗，以 PBS 代替一抗作为阴性对照，4℃湿盒孵育过夜， 加生物素标记的抗兔 IgG 二抗孵育后，用 DAB 显 色液显色，苏木精复染，中性树脂固定封片，每 张切片随机选取 5 个视野进行图像采集，并利用 美国 universal imaging porporation 图像分析系统， meta morph 软件测定其光密度值（OD 值）进行比 较。 1.6　Western blot 测定肺组织中瘦素及瘦素受体的表达

参 照 说 明 书 提 取 小 鼠 肺 组 织 蛋 白，聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳（SDS-PAGE） 采 用 8% 与10% 的分离胶和浓缩胶，电泳条件：浓缩胶内 100 V×40 min，分 离 胶 内 120 V×120 min。 然 后 180 mA×70 min 电 转 移。 最 后 免 疫 学 检 测 时 一 抗 的 工 作 浓 度 为 1 : 500，二 抗 的 工 作 浓 度 为 1 : 5 000，增强化学荧光剂（ECL）用于化学曝光。 Western blot 图像应用 Image J 软件分析，以目的蛋 白与内参 GAPDH 灰度值的比值进行半定量分析。 1.7　Real-time PCR 法检测肺组织中的瘦素及瘦素受体 mRNA 的表达

参照 TRIzol 说明书对各组小鼠进行肺组织 总 RNA 提取，测 RNA 浓度后调整 RNA 体积，取 1 μg RNA 用逆转录试剂盒合成 cDNA。瘦素上游引 物：5'-CCCTTCCAGCCAGGTCATA-3'，下游引物： 5'-TCCTCCAAAATCTACCTCCAACTC-3'，片 段 长 度 87 bp；瘦素受体上游引物：5'-CCAGATTCGATATGGCTTAAGTGGA-3'，下游引物：5'-CAGCGAACCTGGACCACATAGA-3'，片段长度 129 bp； β-actin 上游引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC- 3'，下游引物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'， 片段长度 159 bp。反应体系（20 μL）：上下游 引 物 各 1 μL，cDNA 模 板 1 μL，2×Eas Taq PCR SuperMix 10 μL，其 余 以 ddH₂O 补 充。 扩 增 条 件：95 ℃ 预 变 性 5 min；95 ℃ 变 性 30 s，55 ℃ 退 火 45 s，72 ℃ 延 伸 45 s，35 个 循 环；72 ℃ 延 伸 10 min 终止反应。根据标准曲线，荧光定量 PCR 仪（ABI7500 型号）自动分析并计算出每个样本的 CT 值，瘦素及瘦素受体 mRNA 的相对表达量应用 2^-ΔΔCT 方法得出相对倍数。 1.8　统计学分析

采用 SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计学分 析，计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，多 组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采 用 SNK-q 检验。 P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　一般表现

哮喘组雾化激发后出现烦躁不安、呼吸急促、 抓耳挠鼻、腹肌抽搐和大小便失禁等表现，多次 激发后出现毛色失去光泽、体重增长缓慢；布地 奈德干预组上述症状较轻；对照组无上述症状。 2.2　各组小鼠肺组织病理改变

HE 染色可见诱喘 3 d 组小鼠支气管壁周围有 大量炎性细胞浸润，肺泡腔增大、破裂、融合， 诱喘 7 d 组小鼠肺组织炎症反应更加明显，支气管 壁周围及支气管内都有大量炎性细胞的渗出，布 地奈德干预组小鼠炎症细胞浸润均轻于两哮喘组。 对照组肺组织几乎无上述病理改变。见图 1。

图 1 各组小鼠左肺组织病理形态学变化化（苏木精 - 伊 红染色，×400）　　A 为对照组；B 为诱喘 3 d 组；C 为诱喘 7 d 组； D 为布地奈德干预组。诱喘 3 d 组小鼠支气管壁周围有大量炎性细 胞浸润，肺泡腔增大、破裂以及融合；诱喘 7 d 组小鼠肺组织炎症 反应更加明显；而布地奈德干预组小鼠支气管壁周围炎症细胞浸 润均轻于两哮喘组；对照组肺组织几乎无上述病理改变。

肺组织中瘦素蛋白在哮喘组表达均较对照组 显著增高（均 P<0.01）；诱喘 7 d 组肺组织中瘦素 蛋白表达较诱喘 3 d 组显著增高（P<0.01）；布地 奈德干预组肺组织中瘦素蛋白表达与诱喘 7 d 组比 较差异无统计学意义（P=0.297）。见表 1、图 2。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体光密度值比较（x±s）

表 1 各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体光密度值比较　（x±s）

图 2 　瘦素蛋白在各组小鼠肺组织中的表达（DAB 染色， ×400）　　A 为对照组；B 为诱喘 3 d 组；C 为诱喘 7 d 组；D 为 布地奈德干预组。棕褐色为瘦素阳性表达，其中对照组瘦素蛋白 表达最少；诱喘 3 d 组瘦素蛋白表达较少；诱喘 7 d 组和布地奈德 干预组瘦素蛋白表达较多。

肺组织中瘦素受体蛋白在哮喘组表达较对照 组均显著降低（均 P<0.01）；诱喘 7 d 组肺组织 中瘦素受体蛋白表达与诱喘 3 d 组比较差异无统 计学意义（P=0.111）；布地奈德干预组肺组织中 瘦素受体蛋白表达较对照组和哮喘组均显著增高 （P<0.01）。见表 1、图 3。

图 3 　瘦素受体在各组小鼠肺组织中的表达（DAB 染色， ×400）　　A 为对照组；B 为诱喘 3 d 组；C 为诱喘 7 d 组；D 为 布地奈德干预组。棕褐色为瘦素受体阳性表达，其中对照组瘦素 受体蛋白表达较多；诱喘 3 d 组和诱喘 7 d 组瘦素受体蛋白表达较 少；而布地奈德干预组瘦素受体蛋白表达最多。

Western blot 结果表明诱喘 3 d 组瘦素表达较对照组明显增高（P<0.01）；诱喘 7 d 组瘦素表 达较 3 d 组明显增高（P<0.01）；布地奈德干预 组瘦素水平与诱喘 7 d 组相比差异无统计学意义 （P=0.108）。诱喘 3 d 组瘦素受体较对照组表达 明显降低（P<0.01）；诱喘 7 d 组瘦素受体水平与 3 d 组比较差异无统计学意义（P=0.139）；布地奈 德干预组瘦素受体表达较对照组和哮喘组均明显 增高（P=0.002）。见表 2、图 4。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体蛋白水平比较（x±s）

表 2 各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体蛋白水平比较　（x±s）

图 4 　Western blot 检测肺组织中瘦素和瘦素受体蛋 白表达　A：对照组；B：诱喘 3 d 组；C：诱喘 7 d 组；D：布 地奈德干预组。

诱 喘 3 d 组 瘦 素 mRNA 水 平 较 对 照 组 明 显 增 高（P<0.01）； 诱 喘 7 d 组 瘦 素 mRNA 水 平 较 3 d 组明显增高（P<0.01）；布地奈德干预组瘦素 mRNA 水平与诱喘 7 d 组比较差异无统计学意义 （P=0.347）。瘦素受体 mRNA 水平在对照组、诱 喘 3 d 组、诱喘 7 d 组和布地奈德干预组中比较， 差异无统计学意义（P=0.963）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 　各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体 mRNA 的相对 扩增倍数（x±s）

表 3 　各组小鼠肺组织中瘦素及瘦素受体 mRNA 的相对 扩增倍数（x±s）

瘦素主要是由白色脂肪合成和分泌的一种多 肽类激素，其受体在肺组织中广泛表达，具有免 疫调节和促炎作用 ^{[8, 9]}。近年来有研究显示，哮喘 病人血清瘦素水平较健康人明显升高 ^[10]，随着患 者哮喘病情加重，血浆瘦素水平亦明显升高，瘦 素水平与哮喘严重程度呈正相关 ^{[11, 12]}。因而，瘦 素在哮喘发病中的作用逐渐受到重视。瘦素在哮 喘发病中的可能机制：（1）增加气道高反应性： Shore 等 ^[13] 用 OVA 致敏的 Balb/c 小鼠哮喘模型研 究发现，皮下注射瘦素可提高血清瘦素和 IgE 水 平，并加重气道高反应性，而皮下注射生理盐水 组气道反应无明显变化，提示瘦素可增加气道高 反应性；（2）加重气道炎症反应：Mancuso 等 ^[14] 发现给肺炎球菌肺炎的小鼠模型腹腔注射瘦素后， 其支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞数、巨噬细胞 炎症蛋白、IL-6 和中性粒细胞趋化因子增高、肺 泡巨噬细胞杀菌能力增强，以及白三烯合成增加； Johnston 等 ^[15] 也发现，给予外源性瘦素可使暴露 于臭氧中的小鼠肺泡灌洗液中的脱落上皮细胞增 加，而上皮细胞脱落是支气管哮喘气道炎症的主 要机制之一；（3）调节 Th1/TH₂ 细胞反应：研究 证实，瘦素可协调促进 T 淋巴细胞增殖，并增加 CD4⁺T 细胞对丝裂原的增殖反应，从而改变 T 淋 巴细胞因子的产生，增加 Th1 细胞因子的表达， 减少 TH₂ 细胞因子的产生 ^{[16, 17]}。

本研究从分子和基因水平检测不同严重程度 哮喘小鼠肺组织中的瘦素及瘦素受体表达的变化， 结果显示在哮喘小鼠肺组织中，瘦素呈高水平表 达，瘦素受体呈低水平表达，这可能是由于升高的瘦素转运或者信号传导出现缺陷而产生了瘦素 抵抗现象。瘦素及其受体在气道上皮细胞中的表 达明显高于肺组织其他部位，这说明瘦素及其受 体可能主要通过对气道上皮细胞的改变参与哮喘 的发病。Beuther 等 ^[18] 在人的体外支气管上皮细胞 研究中发现瘦素可以降低转化生长因子 -β 的自发 性释放从而促进气道上皮细胞的增殖，在重度哮 喘患者的支气管上皮表面瘦素受体的表达相对降 低，而经过氟替卡松治疗后其表达明显升高，这 与本研究的结果一致。

糖皮质激素是控制哮喘气道炎症的首选药物， 因此本研究选用布地奈德雾化吸入干预哮喘小鼠， 经布地奈德雾化干预后哮喘小鼠肺组织中瘦素的 表达稍有减少，减少的并不明显，而瘦素受体表 达却明显升高，说明布地奈德在缓解哮喘的同时， 也改善了瘦素抵抗，瘦素又可以与足够的受体结 合而发挥生物学效应，这可能是哮喘难以控制的 原因之一。瘦素是肥胖者脂肪组织表达的促炎分 子，它能够独立于肥胖而促进哮喘的气道炎症， 并以中性粒细胞和 Th1 型炎症反应增强为特点 ^[19]。 此外，瘦素还可以直接作用于人的气道平滑肌细 胞，诱导其分泌血管内皮细胞生长因子以参与哮 喘气道重塑的发生 ^[20]。有研究发现，瘦素可通过 诱导气道平滑肌细胞表达 GR-β 以参与哮喘的激素 抵抗的发生。本研究结果显示通过布地奈德干预 后的哮喘小鼠肺组织瘦素受体明显升高，瘦素可 以与更多的瘦素受体结合而发挥生物学效应，瘦 素可诱导气道平滑肌表达 GR-β，进一步增加激素 抵抗，使哮喘更加难以控制。因此，进一步研究 瘦素及其受体与哮喘的发病机制的关系，可以为 临床的治疗难治性哮喘提供新的思路。

本研究表明在哮喘小鼠肺组织中，瘦素呈高 水平表达，瘦素受体呈低水平表达，布地奈德可 以上调瘦素受体的表达，而对瘦素表达无明显影 响。