支气管哮喘（简称哮喘）是一种异质性的多 因素疾病，现在认为哮喘与过敏性和非过敏性刺 激时 Th2 型细胞免疫应答水平高于 Th1 型细胞免 疫应答水平有关，从而导致慢性气道炎症 ^[1]。近 年来发现表观遗传学机制也可能起重要作用 ^[2]， 但目前国内哮喘领域在表观遗传学方面的研究较 少。目前哮喘表观遗传学研究主要集中在两种调 控方式 ^{[3, 4]}，即 DNA 甲基化和组蛋白修饰，其中 最主要的修饰是组蛋白的乙酰化修饰。组蛋白的 乙酰化与炎症基因诱导和细胞增殖有关。组蛋白 乙酰化和组蛋白去乙酰化分别由组蛋白乙酰基转 移酶（histone acetyltransferase,HAT）和组蛋白去 乙酰基酶（histone deacetylase,HDAC）所催化。内 源性的 HDAC 活性对维持 Th1 型免疫应答和 T 型 免疫应答平衡及抑制过度 Th2 型免疫应答起至关 重要的作用 ^[5]。但 HAT 与 HDAC 活性及组蛋白乙 酰化修饰与儿童哮喘及婴幼儿喘息的表现型的关 系目前不清楚。有研究显示 HDAC 的表达水平可 能与儿童哮喘的严重程度有关 ^[6]，曲古抑菌素 A （trichostatin,TSA）作为 HDAC 抑制剂，是否对哮 喘有治疗作用，与常用的哮喘治疗药物糖皮质激 素作用有何差别有待研究。为此，本实验通过构 建哮喘小鼠模型，并分别予 HDAC 抑制剂 TSA 及 地塞米松（dexamethasone,Dex）进行干预，观察 哮喘中各种细胞因子及 HAT、HDAC 活性的变化 规律，比较 TSA 及 Dex 对其的治疗作用的差异， 探讨组蛋白乙酰化修饰在哮喘发病机制中的作用。 1　材料与方法 1.1　实验材料

SPF 级 6~8 周龄雄性 BALB/c 小鼠 32 只，购 自苏州大学比较医学中心，平均体重为 20±2 g， 无 卵 蛋 白 饮 食。 氢 氧 化 铝 凝 胶 及 卵 清 蛋 白 （ovalbumin,OVA）购于 Solarbio 公司（中国）， TSA 购于 Beyotime 公司（中国），酶联免疫试剂 盒购于 Rabiotech 公司（美国），酶联免疫荧光法 试剂盒购于 Epigentek 公司（加拿大）。 1.2　动物分组及哮喘模型制备

小鼠按随机数字表法分为对照组、哮喘组、 激素治疗组和 TSA 治疗组，每组 8 只。哮喘小鼠 模型制作方法参照文献 ^[5]：在实验前及实验第 7、14 天，腹腔注射 10%OVA 溶液 0.1 mL+10% 氢氧 化 铝 凝 胶 0.2 mL 致 敏，每 日 1 次； 实 验 第 21、 23、25、27、29 天，0.2%OVA 溶液 50 μL 雾化激发， 每日 1 次，每次 30 min。对照组小鼠在致敏及激 发阶段各时间点分别以等量生理盐水替代注射和 雾化吸入。激素治疗组每次激发前 30 min 腹腔注 射 Dex 0.2 mL（1.0 mg/kg）。TSA 治疗组每次激发 前 30 min 腹腔注射 TSA 0.2 mL（1.0 mg/kg）。 1.3　标本采集及处理

于末次激发 24 h 后，各组小鼠行腹腔注射水 合氯醛（10 mg/kg）麻醉。眼球取血法取血 2 mL， 1 mL 置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的 1.5 mL 离心管中，待测血常规；另 1 mL 置于肝素 锂抗凝管中，离心 5 min，取血清用于检测细胞因子， 沉淀物用于分离单个核细胞。 1.4　Ficoll-Hypaque 密度分离法分离单个核细胞

取肝素锂抗凝的外周血 1 mL 与等量生理盐水 充分混合，沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液 面上，注意保持清楚的界面。2800 rpm 水平离心 15 min。离心后管内分为 3 层，上层为血浆和生理 盐水，下层主要为红细胞和粒细胞，中间层为淋 巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核 细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括 淋巴细胞和单核细胞。用毛细吸管插入到云雾层， 吸取单个核细胞，置于 1.5 mL 离心管中，加入 5 倍以上生理盐水，10 000 rpm 离心 1 min，洗涤细 胞 2 次。 1.5　血常规检测及 ELISA 法检测外周血细胞因子

EDTA 抗凝管上机检测血常规。IL-4、IL-8、 IFN-γ 试剂盒购自 Rabiotech 公司，所有步骤严格 按照试剂盒说明书执行。 1.6　酶联免疫荧光法检测外周血单个核细胞中HAT 和 HDAC 活性

HAT 和 HDAC 活性荧光分析试剂盒均购自 Epigentek 公司。所有步骤严格按照试剂盒说明书 执行。 1.7　统计学分析

应用 SPSS 19.0 统计学软件对数据进行统计学 分析，正态分布计量资料采用均数 ± 标准差（x±s） 表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较 采用 SNK-q 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　哮喘症状

对照组小鼠在激发期间表现较为烦躁，无其 他阳性表现。哮喘组小鼠在激发期间出现焦躁不 安、呼吸急促、打喷嚏等阳性反应，但并不明显。 激素治疗组及 TSA 治疗组小鼠在激发期间亦表现 为焦虑、烦躁，但症状较哮喘组有所缓解。 2.2　各组血清细胞因子水平

哮喘组小鼠血清中 IL-4 和 IL-8 水平较对照组、 激素治疗组和 TSA 治疗组均升高（P<0.05），而 IL-4 和 IL-8 水平在对照组、激素治疗组和 TSA 治 疗组 3 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）； 4 组间 IFN-γ 水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。 见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠血清细胞因子浓度比较　（x±s, pg/mL）

表 1 各组小鼠血清细胞因子浓度比较　（x±s, pg/mL）

哮喘组小鼠 HDAC 活性较对照组、激素治疗 组和 TSA 治疗组均降低，HAT 活性较激素治疗组 明显升高（P<0.05）；而 HDAC 和 HAT 活性在对 照组、激素治疗组和 TSA 治疗组 3 组间比较差异 均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠外周血单个核细胞中 HDAC 和 HAT 活性 比较（x±s, RFU/（h·μg））

表 2 各组小鼠外周血单个核细胞中 HDAC 和 HAT 活性 比较　（x±s, RFU/（h·μg））

近几十年来，全球哮喘发病率持续升高，严 重影响患者的身心健康及生活质量，加重家庭和 社会的经济负担，已经成为全球关注的疾病。哮 喘亦是儿童常见的一种气道变应原性慢性炎症性 疾病，其发病机制与环境因素、遗传因素、气道 高反应性、炎性介质分泌增多、Th1/Th2 失衡等均 有密切关系。从病理上可分为过敏性哮喘和非过 敏性哮喘，但二者区别仍然不十分清楚。现在认 为哮喘与过敏性和非过敏性刺激时 Th2 型细胞免 疫应答水平高于 Th1 型细胞免疫应答水平有关， 从而导致慢性气道炎症。研究显示哮喘发病危险 因素中最重要的是遗传和环境因素，由于遗传背 景不可能在短时间内出现显著变化，因此，环境 因素可能起到关键作用。近年来，随着表观遗传 学的提出，人们已经认识到遗传和环境是密切相 关的两个因素，环境改变可以影响遗传。

随着研究的进一步深入，越来越多研究表明 表观遗传修饰在环境和遗传因素之间起到重要作 用，其中与哮喘发病机制密切相关的是组蛋白乙 酰化修饰 ^[1]。本研究建立了哮喘小鼠模型，通过对 小鼠症状的观察及相关因子的检测，验证 HDAC、 HAT 在哮喘发病中的作用，并研究 IL-4、IL-8 等 细胞因子与组蛋白乙酰化是否存在相关性，比较 Dex 与 TSA 疗效差异，进而以组蛋白乙酰化作为 切入点，研发新的哮喘治疗药物。

研究过程中发现，对照组小鼠在激发期间较 为烦躁，无其他阳性表现，可能由雾化过程中轻 度缺氧引起。哮喘组小鼠在激发期间出现焦躁不 安、呼吸急促、打喷嚏等哮喘症状，提示哮喘小 鼠模型构建成功。激素治疗组、TSA 治疗组小鼠 激发期间亦表现为焦虑、烦躁，但症状较哮喘组 有所缓解，提示 Dex 及 TSA 均有缓解哮喘症状的 作用。

本研究结果显示，与对照组组比较，哮喘组 血 清 中 IL-4 水 平 升 高，众 所 周 知，IL-4α 由 Th2 淋巴细胞分泌，说明哮喘模型小鼠体内存在 Th2 细胞优势反应及 Th1/Th2 型细胞因子比例失衡。 而 TSA 治疗组血液中 IL-4 水平低于哮喘组，且 哮喘症状减轻，提示去乙酰化酶抑制剂 TSA 对哮 喘有治疗作用，治疗机制则是通过抑制组蛋白乙酰化修饰，从而减少炎症因子分泌。然而经 Dex 治疗及 TSA 治疗后，IL-4 水平差异并不显著，说 明 Dex 及 TSA 降低炎性因子分泌的效果无明显差 异，可以推测 Dex 及 TSA 在治疗哮喘的机制方面 可能存在某些共同点。众所周知，糖皮质激素是 目前控制气道炎症最有效的药物，而其之所以能 够抑制炎症治疗哮喘主要是通过以下两种方式：

（1）抑制 HAT 活性、招募 HDAC2 而抑制炎症基 因的表达：糖皮质激素可以抑制 HAT 的活性，招 募 HDAC2，诱导组蛋白去乙酰化。在支气管哮喘 患者体内存在 HAT 活性的增高及 HDAC 活性的下 降，前炎症转录因子如 AP-1 和 NF-κB 介导 DNA 解螺旋，从而利于各种转录因子的结合诱导炎症 基因的表达。糖皮质激素一方面通过激活的激素 受体（GR）直接与 CRBE 连接蛋白或其他共刺激 因子结合来抑制 HAT 的活性，靶基因下调；一方 面则通过招募 HDAC2，诱导组蛋白去乙酰化，来 达到抑制哮喘炎症的作用 ^{[7, 8, 9, 10, 11]}。本研究结果显示 Dex 干预过的小鼠外周血中 IL-4 浓度较哮喘组明 显下降，而外周血单个核细胞中 HAT 活性亦下降， 证实了以上观点。（2）诱导组蛋白乙酰化来促进 抗炎因子表达：大剂量糖皮质激素可诱导乙酰化。 糖皮质激素与胞浆中 GR 的结合，GR 将与之结合 的糖皮质激素转移至细胞核内，结合至糖皮质激 素识别位点（GRE），并与 HAT 的共刺激因子连接， 诱导组蛋白乙酰化，从而增加抗炎因子的表达 ^{[8, 9, 10, 11]}。 本实验尚未对此机制进行探究，但可以证实糖皮 质激素及 TSA 均有诱导乙酰化作用。有研究发现， Dex 及 TSA 均能显著抑制哮喘小鼠辅助性 T 淋巴 细胞 2 型细胞因子 IL-4 的分泌，但都无升高 IFN-γ 的作用 ^[12]，这与本实验结果是相符的。

另外，本研究中发现，哮喘组血清中的 IL-8 水平升高。IL-8 是哮喘发病相关细胞因子网络的 重要成员，具有趋化中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 T 淋巴细胞、单核细胞的作用，诱导中性粒细胞变 形、激活，使其定向游走，促进细胞内游离钙离 子浓度一过性升高，诱导其脱颗粒、释放蛋白水 解酶和氧自由基、花生四烯酸等一系列炎性介质， 诱导黏附分子的表达，引起呼吸爆发，从而促进 炎症反应 ^[13]。同时，IL-8 趋化并激活嗜酸性粒细 胞合成与释放阳离子蛋白，并能引起气道黏膜下 微血管通透性增加、腺体分泌亢进、平滑肌收缩及气道上皮细胞脱落，参与哮喘急性发作期和非 急性发作期的炎症反应，属调节哮喘气道炎症的 上调因子 ^[14]。本课题研究发现哮喘小鼠模型血清 中 IL-8 水平明显高于对照组，与有关哮喘患者的 报道结果相符 ^[15]，因此可以看出 IL-8 参与哮喘的 炎症过程，故 IL-8 水平的监测可作为反映支气管 哮喘气道炎症和观察病情变化的重要指标。目前， 有实验证实经 Dex 干预后肺组织中 IL-8 和蛋白表 达水平明显低于哮喘组，而高于对照组 ^[16]。本研 究中，经 Dex 和 TSA 干预后亦见 IL-8 浓度较哮喘 组降低，且两组间差异无统计学意义，进一步证 实 Dex 与 TSA 在下调 IL-8 水平上没有明显差异。

本研究还发现，哮喘组 HDAC 活性较其余 3 组均降低，HAT 活性较激素治疗组明显升高，与 对照组、TSA 治疗组差异无统计学意义。有研究 证实，在哮喘患者的气道标本及肺泡灌洗液的巨 噬细胞中，HAT 活性明显升高，而 HDAC 活性则 降低，且哮喘患者体内 HAT 活性与升高的炎症基 因表达相关 ^[17]。本实验小鼠体内 HAT、HDAC 的 改变符合上述研究结果。在应用 TSA 后能显著缓 解小鼠哮喘症状，改善气道阻力及肺顺应性，减 轻小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润 ^[12]，这一改变可能 与组蛋白乙酰化活化炎症基因有关。综合文献， 可知组蛋白乙酰化 / 去乙酰化修饰在哮喘发病中的 作用可能与诱导 Th1/Th2 失衡、调节炎症介质表 达等有关。（1）Th1/Th2 失衡：最近的研究显示 HDAC 在 Th1/Th2 型反应的产生与维持过程中起到 重要作用 ^[18]。在 T 细胞特异性 HDAC1 基因敲除 小鼠气道内发现炎症反应的增大，嗜酸粒细胞募 集，黏膜高反应性，肺实质炎症以及气道抵抗， Th2 分泌 IL-4 亦升高，倾向于 Th2 反应 ^[19]。应用 组蛋白去乙酰酶化抑制剂 TSA 可使 T 细胞高度乙 酰化，Th1/Th2 比值降低 ^[20]，这与本实验小鼠研究 结果相符，充分证实 HDAC 有利于维持 Th1/Th2 平衡，反之乙酰化过程则将引起 Th1/Th2 失衡，从 而诱发哮喘发生。（2）炎症介质活化：炎性蛋白 TNF-α、IL-8 分泌增加，组蛋白乙酰化可能导致基 因转录，编码炎性蛋白，如 IL-8、TNF-α 等。但哮 喘发病还是否与组蛋白乙酰化 / 去乙酰化修饰增加 气道高反应性、氧化 / 硝化应激等有关，有待进一 步证实。

综上所述，本研究发现，哮喘模型小鼠体内IL-4 显著升高，出现以 Th2 细胞优势反应，存在 Th1/Th2 型细胞因子比例失衡。而 TSA 是通过抑 制组蛋白乙酰化修饰，减少炎症因子分泌。Dex 及 TSA 均能抑制哮喘小鼠 Th2 型细胞因子 IL-4 的分 泌，但都缺乏升高 IFN-γ 的作用。哮喘小鼠模型 血清中 IL-8 水平明显高于对照组，因此可以看出 IL-8 参与哮喘的炎症过程。经 Dex 和 TSA 干预后 外周血 IL-8 浓度水平明显低于哮喘组。本实验哮 喘小鼠体内 HAT 活性增高，HDAC 活性降低，应 用 TSA 后能显著缓解小鼠哮喘症状。Dex 与 TSA 治疗后 HDAC 活性均显著升高，但在降低 HAT 活性方面糖皮质激素更为显著。而这一结果并未 影响二者降低炎性因子分泌的作用。哮喘发病与 Th1/Th2 型细胞因子比例失衡、炎症介质活化等密 切相关，其还是否与组蛋白乙酰化 / 去乙酰化修饰 增加气道高反应性、氧化 / 硝化应激等有关，有待 进一步证实。

志谢：感谢无锡市人民医院检验科张健老师 在标本检测中给予的帮助。感谢无锡市人民医院 中心实验室穆会君老师、殷莹老师等在本实验中 给予的悉心指导。感谢郭赟、邢朝凤、潘姗姗在 实验过程中给予的帮助。