新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是新生儿科严重的疾病，威胁着新生儿的生命^[1]，寻找其有效的治疗方案具有重要意义。细胞移植与高压氧（HBO）治疗是目前HIE比较有希望的两种治疗方案。近年来，脐血库的兴起为细胞治疗提供了新的来源，研究发现脐血单个核细胞（umbilical cord mononuclear cells,UCBMC）脑内移植可存活，并减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）^[2]，但不能完全抑制脑组织损伤。研究还发现HBO不仅可减轻HIBD^[3]，且可改善损伤神经组织的微环境，抑制免疫炎症反应，促进细胞移植^{[4, 5]}，本课题组在前期工作也中发现UCBMC移植可减轻新生大鼠HIBD程度，其疗效显著优于单纯介质组^[6]。那么UCBMC联合HBO治疗是否可改善UCBMC移植的疗效呢？目前该方面的研究报道甚少。故本研究采用UCBMC联合HBO治疗新生大鼠HIBD，并观察其对远期行为学、组织学的影响并探讨其对炎症因子白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）蛋白的影响及机制，以期为HIBD的治疗选择最佳的治疗方案。 1　材料与方法 1.1　实验动物及分组

健康 7日龄 Sprague-Dawley（SD）新生大鼠 （清洁级，由山东省中医药大学提供并批准使用），雌雄不限，体重12.1~15.6 g，平均13.9±1.6 g，随机分为4组：（1）正常对照组，不做任何处理；（2）缺氧缺血性脑损伤组（HIBD组）；（3）UCBMC组（HIBD后24 h单纯移植UCBMC）；（4）UCBMC+HBO组（HIBD后3 h，行HBO治疗，HIBD后24 h移植UCBMC）；各组分别于移植后24 h、28 d处死大鼠。 1.2　主要试剂与设备

人全血单个核细胞分离液购自天津TBD公司；IL-1β、TNF-α抗体购自美国Santa Cruz公司；常压氧舱（武汉七0一研究所）；婴儿高压氧舱（武汉七0一研究所）；大鼠脑立体定位仪（深圳瑞奥德公司）；5 μL微量注射器（上海生物工程有限公司）；正置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；石蜡切片机（英国Shanton公司）；电子分析天平（美国梅特勒公司）；放射性迷宫（DL-REB，中国东乐公司）、T迷宫（DL-RTM，中国东乐公司）。 1.3　HIBD模型的制作

采用经典Rice-Vannucci方法^[7]制成 HIBD模型，乙醚吸入麻醉，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉双线结扎，并在结扎中间剪断，后置于 8.00％±0.01％低氧舱内缺氧 2 h，舱内温度控制在 36.0±1.0℃，湿度为 70%±5％。实验结束后，将大鼠放回鼠笼，由母鼠喂养。正常对照组不做任何处理。 1.4　HBO治疗

HIBD后3 h内，UCBMC+HBO组大鼠行 HBO治疗，每日治疗1次，连续治疗 7 d，方法如下：（1）洗舱：纯氧洗舱15 min，流量10 L/min；（2）升压：纯氧升压15~20 min，流量为5~8 L/min；（3）稳压：2个绝对大气压稳压治疗60 min，监测氧气浓度不低于 85%；（4）减压：匀速减压，20~30 min内减压完毕^[8]。 1.5　UCBMC的采集、分离与移植

经足月孕妇知情并同意，采集脐血约50 mL，0.01 mol/L灭菌磷酸盐缓冲液等体积稀释，灭菌试管中先加入人单个核细胞分离液，缓慢加入稀释血（稀释血与单个核细胞分离液的体积比约为2 : 1），2 000 r/min离心20 min，吸取中间白膜层的单个核细胞。生理盐水洗涤并制成单个核细胞悬液，置冰上备用。造模后24 h，UCBMC组与UCBMC+HBO组大鼠分别置于大鼠立体定位仪上，左侧侧脑室（AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm）注入UCBMC悬液，每只大鼠注入 3×10⁶个/2 μL活细胞，缓慢注入，留针5 min，拔针缝合头皮，复温苏醒后回笼饲养。 1.6　Western blot法检测 IL-1β与TNF-α蛋白的表达

移植 24 h^[9]，断头取脑处死各组大鼠（n=8），每只大鼠取左脑前囟前1.0 ~ -4.5 mm脑组织，立即放入液氮研磨，加入全细胞裂解液提取总蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取60 μg蛋白，10%的聚丙烯酰胺分离胶分离，电压300 V，湿转膜1 h，50 g/L的脱脂奶粉室温封闭1~2 h，分别加入IL-1β（1 : 1 000）、TNF-α（1 : 2 000）、GAPDH（1 : 1 000）一抗，4℃孵育过夜。洗膜后，加入相应的二抗室温孵育2 h，采用ECL化学发光试剂盒显影，曝光，扫描，凝胶成像系统分析目的蛋白的光密度值，计算其与相应GAPDH光密度值的比值并行统计学分析。 1.7　T迷宫试验

自22日龄起进行T迷宫测试（n=8），左右两臂的末端放置约40 mg的食物。测试分为预备和测试两个阶段。预备阶段时，训练大鼠在T迷宫的一臂觅食后，15 s后需进入另一臂觅食，觅食适应2 d后，进入正式测试。每只动物每日测试5次，每次间隔15 min，连续4 d，并记录每日测试的正确率。 1.8　空间学习记忆能力放射性迷宫测试

自30日龄起，进行放射性迷宫测试（n=8）。测试前禁水48 h，仅傍晚饮水30 min。开始2 d在每个臂的孔内都放50 μL水，让动物在迷宫内自由觅水。空间测试时在3个相邻角度分别为135°、90°和135°的臂内加水，每天测试5次，每次间隔1 min，连续测试3 d，每次测试时，大鼠放在迷宫中央面朝固定的第3臂，3个臂的水都被找到时实验结束，记录找到3个臂的水所花的时间以及记忆错误的次数（即进入没有水的臂的次数）^[10]。 1.9　Nissl染色

移植后4周，各组大鼠常规灌注后取脑（n=8），常规包埋并制成脑组织石蜡切片，脱腊至水。0.1%甲苯胺蓝 60℃孵育 1 min，水洗，70%、80%乙醇脱水各1 min，95%酒精镜下分化，直至细胞核及其背景均为淡蓝或无色，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用 Cellsens 16.0分析软件，计数损伤侧海马CA1区单位面积锥体细胞数。 1.10　统计学分析

采用 SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，所有计量资料用均数±标准差（x±s）表示，方差齐性资料采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　IL-1β与TNF-α蛋白的Western blot结果

移植后 24 h，各组 IL-1β和TNF-α蛋白表达差异均有统计学意义（F值分别为31.0和70.99，均P<0.01）。其中HIBD组IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.01）；UCBMC组IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显低于 HIBD组（均P<0.01），但仍高于对照组（均P<0.01）；UCBMC+HBO组IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显低于 HIBD组及 UCBMC组（P<0.01，P<0.05），但仍明显高于对照组（P<0.05）。见图 1。

图 1UCBMC联合HBO治疗对HIBD大鼠脑IL-1β与TNF-α蛋白的影响上图为电泳条带结果:1为对照组,2为HIBD组,3为UCBMC组,4为UCBMC+HBO组。下图为统计结果:a示与对照组比较,P<0.01;b示与对照组比较, P<0.05;c示与HIBD组比较,P<0.01;d示与UCBMC组比较,P<0.05。

在连续 4 d测试中，对照组、UCBMC组、UCBMC+HBO组的正确率逐渐增高，而HIBD组正确率上升不明显；测试第4 d时UCBMC组正确率较HIBD组明显提高（P<0.01），但仍低于对照组（P<0.01），UCBMC+HBO组正确率明显高于HIBD组及UCBMC组（P<0.01，P<0.05），但仍低于对照组（P<0.05）。见图 2。

图 2各组T迷宫实验结果a示与对照组比较,P<0.01;b示与对照组比较,P<0.05;c示与HIBD组比较,P<0.01;d示与UCBMC组比较,P<0.05。

HIBD组大鼠觅水时间（147±13 s）显著长于对照组（102±9 s），而错误次数（14.0±1.2）显著高于对照组（9.7±1.0）（均P<0.01）。UCBMC组觅水时间（122±10 s）较 HIBD组显著减少（P<0.01），仍高于对照组 （P<0.01），其错误次数（12.0±1.2）显著高于对照组（P<0.01），但仍低于HIBD组（P<0.01）。UCBMC+HBO组觅水时间（111±10 s）较HIBD组及UCBMC组均明显减少（均P<0.01），但仍明显高于对照组（P<0.05）；其错误次数（10.8±1.1）较HIBD组及UCBMC组均减少（均P<0.01），但仍明显高于对照组（P<0.05）。见图 3。

图 3各组放射性迷宫实验觅水时间（左）及错误次数（右）比较a示与对照组比较,P<0.01;b示与CON组比较,P<0.05;c示与HIBD组比较,P<0.01;d示与UCBMC组比较,P<0.01。

对照组海马CA1区锥体细胞排列整齐，形态规则，尼氏体呈大颗粒，且数量较多；而 HIBD组损伤侧海马CA1区锥体细胞排列不整齐，形态不规则，神经元数目明显低于对照组（P<0.01）；UCBMC组损伤侧海马CA1区锥体细胞排列较整齐，神经元数目高于 HIBD组（P<0.01），但仍低于对照组（P<0.01）；UCBMC+HBO组损伤侧海马CA1区锥体细胞胞浆中尼氏体清晰可见，神经元数目显著多于UCBMC组（P<0.05）及HIBD组（P<0.01），但仍低于对照组（P<0.05）。见图 4。

图 4各组损伤侧海马CA1 区锥体细胞数比较左图为尼氏染色图(×400):A:对照组;B:HIBD组;C:VCBMC组;D:VCBMC+HBD组。右图为统计图:a示与对照组比较,P<0.01;b示与对照组比较,P<0.05;c示与HIBD组比较,P<0.01;d示与UCBMC组比较,P<0.05。

近年来多数研究表明新生儿缺氧缺血后急性炎症反应是导致HIBD的重要原因，减轻炎症反应是HIBD治疗的关键所在。UCBMC含有许多未成熟的干细胞，不仅具有自我更新与向神经细胞分化的潜能，而且可以减轻炎症反应^[11]。IL-1β、TNF-α与新生儿缺氧缺血后炎症反应的发生密切相关，本研究发现HIBD新生大鼠IL-1β、TNF-α蛋白表达明显增加，这与文献报道一致^[12]，而 UCBMC移植后 IL-1β、TNF-α蛋白表达降低，但仍高于对照组，提示UCBMC可减轻炎症反应，但不能完全抑制HIBD新生大鼠的炎症反应。另外本研究发现UCBMC可以改善HIBD大鼠的远期行为学及组织学损伤，但不能完全治愈HIBD，因此，寻求一种新的治疗方案改善UCBMC的治疗效果是本研究的重点。

HBO用于治疗新生儿HIBD已有多年的历史，研究发现 HBO治疗可减轻损伤脑组织的免疫炎症反应^{[13, 14]}，改善脑内微环境促进细胞移植，本研究采用UCBMC联合HBO治疗HIBD，发现UCBMC+HBO组大鼠脑内IL-1β、TNF-α蛋白的表达明显低于HIBD组与UCBMC组，说明UCBMC联合HBO治疗显著优于单纯UCBMC治疗。同时本研究还发现UCBMC与UCBMC联合HBO组均可显著改善HIBD大鼠的远期行为学，且HBO联合UCBM治疗的疗效显著高于单纯UCBMC组；尼氏染色结果也提示UCBMC联合HBO治疗可减轻海马CA1区锥体细胞损伤，促进组织修复，其疗效优于单纯UCBMC治疗。

综上，UCBMC联合HBO治疗可抑制HIBD新生大鼠IL-1β、TNF-α蛋白的表达，促进HIBD大鼠损伤侧海马锥体细胞的修复并改善其远期行为学，优于单纯UCBMC移植，有望成为HIBD治疗的新方案。但是由于经费所限，本研究未设计单纯HBO治疗组，亦未进行单纯HBO治疗组与UCBMC+HBO组的比较，因此，关于是否UCBMC联合HBO治疗优于单纯HBO治疗有待于进一步研究。