支气管哮喘（以下简称哮喘）是一种有多种细胞和炎性介质以及细胞因子参与的，以慢性气道炎症和气道高反应性为主要特征的变态反应性疾病。随着人们生活环境以及生活模式的改变，近些年来儿童哮喘在全球范围内有逐渐增加的趋势^[1]。儿童哮喘受环境因素的影响，又有明显的遗传倾向，已有研究表明多种基因与哮喘的易感性相关^[2]。哮喘与特应性皮炎均属于变态反应性疾病，且特应性皮炎常伴随哮喘的发生^[3]。国内外均有研究利用全基因组关联（GWAS）发现ZNF365基因与特应性皮炎相关^{[4, 5]}，但该基因的多态性与哮喘的相关性未见报道。本研究以我国中部湖北地区哮喘患儿为研究对象，探讨ZNF365基因SNP位点（rs2393903和rs10995251）多态性与哮喘及其临床特点的相关性，以进一步揭示哮喘的遗传学发病机制。 1 资料与方法 1.1 研究对象

2010年7月至2014年6月在我院儿科住院治疗的哮喘患儿221例纳入本研究作为哮喘组，年龄1岁1个月至9岁3个月（平均年龄4±3岁），其中男119例（53.8%），女102例（46.2%）。同时期体检正常的243名儿童作为对照组，年龄1岁10个月至10岁（平均年龄5±3岁），其中男136例（55.9%），女107 例（44.1%）。两组在年龄以及性别比例方面的差异无统计学意义（分别P=0.647、0.214）。两组儿童均来自我国中部湖北地区。

哮喘组的入选标准：（1）哮喘的诊断标准符合中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的哮喘诊断与防治指南^[6]；（2）排除先天性心肺部疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病等。本研究得到受试者家属知情同意以及我院医学伦理委员会的批准。 1.2 ZNF365基因多态性分析

两组儿童均抽取静脉血1mL，利用酚氯仿抽提乙醇沉淀的方法提取基因组DNA。以DNA为模版，利用引物F1：TCAGGCTGACAGTGCAAACTATG,R1：CCTGGACACACACAAACATGCAT扩增含有SNP（rs2393903）的片段；利用引物F2：CTCCAAGATATTGGCAACTCACTATGG 和R2：CAGACATCATCGATGGTCACCAATG 扩增含有SNP（rs10995251）的片段。PCR总反应体系为25 μL，含有10倍PCR 反应缓冲液（含Mg 离子）2.5 μL，10 mM dNTP 混合液1 μL，10 μM 引物各1 μL，TAKARA公司Taq酶1 U；反应条件：94℃3 min预变性；94℃ 30 s变性；54℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共34个循环；最后72℃ 5 min 延伸。分别取5 μL扩增的产物利用内切酶NdeI（识别酶切位点CATATG，NEB公司）以及HaeIII（识别位点GGCC，NEB公司）进行酶切，然后利用3%琼脂糖电泳分析。 1.3 临床资料的收集

临床资料包括患儿性别、年龄、实验室检查结果（外周血淋巴细胞总数、总IgE水平以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例等）。 1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据的统计分析。频率计数法计算哮喘组和对照组基因型和等位基因频率，以频数和百分比表示，利用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。各组间基因型频率分布和等位基因频率分布比较采用χ²检验。计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，多组间均值的比较采用方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 ZNF365基因两个SNP位点基因型的确定及频率分布

哮喘组和对照组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），说明两组具有群体代表性。ZNF365基因两个SNP位点多态性确定如图 1所示：SNP rs2393903 位点的3 种基因型为GG、AA、AG；SNP rs10995251 位点的3 种基因型为CC、TT、CT。含有SNP rs2393903位点的PCR产物经酶切以后GG基因型显示168 bp大小的一条电泳带，AG 基因型显示168 bp和144 bp的两条电泳带，AA基因型为144 bp的一条电泳带。SNPrs10995251 位点片段酶切CC基因型酶切完全，显示一条电泳带（148 bp），TT基因型不被酶切，显示一条174 bp的电泳带，CT基因型则酶切不完全（174 bp和148 bp两条带）。

图 1 ZNF365基因两个SNP位点基因型 A：SNP位点rs2393903的3种基因型：GG、AA、AG；B：SNP位点rs10995251的3种基因型：CC、TT、CT。

χ²检验显示，哮喘组患儿ZNF365基因SNPrs2393903位点的3种基因型与对照组相比差异无统计学意义（P=0.489）。而SNPrs10995251 位点的3种基因型与对照组相比差异具有统计学意义（P=0.034），等位基因频率差异也具有统计学意义（P=0.015），C等位基因为风险因子（OR=1.380），携带CC基因型的人群患哮喘的风险是TT基因型人群的1.981倍，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 ZNF365基因两个SNP位点基因型频率分布[n（%）]

表 1 ZNF365基因两个SNP位点基因型频率分布[n（%）]

对SNP rs10995251位点的3种基因型患儿间主要临床指标的差异进行统计显示，不同基因型的患儿间血清总IgE含量差异有统计学意义（P=0.036），其中CC基因型患儿总IgE水平明显高于TT基因型的患儿（P=0.014），见表 2。但该SNP的多态性与外周血淋巴细胞总数、中性粒细胞比例以及嗜酸性粒细胞比例的水平不相关（表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 ZNF365基因多态性与哮喘患儿临床特点的相关性（x±s）

表 2 ZNF365基因多态性与哮喘患儿临床特点的相关性（x±s）

哮喘是儿童常见的一种由T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞以及支气管上皮细胞等多种细胞和细胞组分共同参与的慢性呼吸道疾病，并且哮喘反复发作，严重影响儿童的健康和生活，2013年我国儿科哮喘协作组进行的全国性的儿童哮喘患病率调查显示我国儿童哮喘的发病率存在上升的趋势^[1]。哮喘作为一种多基因复杂性的疾病，其发病与许多基因和环境因素有关，目前全基因组关联研究发现200多个与哮喘相关的基因，且部分基因在多个人群中得到了验证^[2]。

ZNF365基因定位于10号染色体q21.2区域，编码锌指蛋白365。锌指蛋白是一类可以通过结合锌离子、自身折叠成手指结构的一类转录因子蛋白，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等方面具有重要的作用^[7]。近年来的研究发现特异性的锌指蛋白可参与疾病相关基因的表达调控。国内外均有研究组发现ZNF365与特应性皮炎相关^{[4, 5]}；且有研究发现该基因还与小柳原田（Vogt-Koyanagi-Harada,VKH）^[8]、克罗恩病^[9]以及乳腺癌^[10]的易感性相关。

本研究发现SNP rs10995251位点与小儿哮喘的易感性相关，C等位基因为风险因子（OR=1.380），携带CC基因型的人群患哮喘的风险是携带TT基因型人群的1.981倍。因ZNF365蛋白为转录因子蛋白^[7]，推测该位点可能影响该基因的表达水平，进而导致调控的下游基因表达的改变。该结论需要进一步在细胞水平进行验证，但通过该结果可推测这两种变态反应性疾病可能存在相同的致病机制。Sun等^[5] 研究人员发现ZNF 基因SNPrs2393903 位点与特应性皮炎的易感性相关，G等位基因为风险因素，但本研究结果发现该位点与儿童哮喘的易感性不存在相关性，说明两种疾病间的致病机制存在一定的差异。

哮喘患儿一般具有气道高反应性、血清总IgE水平以及嗜酸性粒细胞比例增高等现象^[6]。本研究统计分析了与哮喘相关的SNP rs10995251 位点多态性与哮喘患儿外周血淋巴细胞总数、IgE以及中性细胞和嗜酸性粒细胞的比例等指标的相关性，结果发现该SNP位点的多态性与哮喘患儿血清总IgE水平相关，具体的机制需要进一步的研究。以上的研究结果表明，ZNF365基因SNPrs10995251位点的多态性与湖北中部地区儿童哮喘的易感性相关，该结论对进一步认识哮喘的遗传学致病机制提供了一定的依据。但本研究仍存在样本量较少的局限性，应进行多地区、多种族的大样本分析，结论才更可靠；另外，基因多态性是否影响ZNF365水平，进而调控下游基因导致疾病发生的机制有待下一步研究。