早产分为自发性早产（spontaneous pretermbirth,SPTB）和治疗性早产两种，其中约75%~85%的早产为SPTB，而SPTB 中约50% 是早产胎膜早破（preterm premature pupture of membranes,PPROM）导致的^[1]。SPTB 的病因和发病机制至今仍不明确，然而，SPTB 的发生具有明显的家族聚集性和种族差异性，说明遗传因素在SPTB 的发病中起重要作用^[2]。目前，国内外关于早产遗传易感性的研究报道较少，相关研究主要集中在探讨与感染、炎症和自身免疫相关的细胞因子方面，如白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、单核细胞趋化因子（MCP）、含硒蛋白S（SEPS）、Toll 样受体（TLR）等的基因单核甘酸多态性与SPTB 和PPROM 遗传易感性的相关性^{[3, 4, 5, 6]}。由于基因的多态性存在种族差异，即使是同一个基因，在不同种族中的研究结果也会出现不一致。因此，针对中国人群进行大样本的早产遗传易感性研究具有十分重要的意义。

2',5'- 寡腺苷酸合成酶1（2',5'-oligoadenylatesynthetase,OAS1）基因是干扰素诱导效应基因（包括MXA、OAS1、PKR 等基因） 之一，而IFN 的生物学效应正是通过有活性的ISG（IFN-stimulatedgenes）的转录表达来实现的。该基因编码的OAS1蛋白是IFN 诱导产生的最重要的酶蛋白之一，OAS1 基因启动子区域的多个功能性单核苷酸多态性不仅和OAS1 蛋白抗病毒感染的活性有关，而且可以通过调节不同细胞因子（Th1/IL-2 和Th2/IL-10）的分泌来诱导机体对风疹病毒活疫苗的不同免疫反应^{[7, 8]}。考虑到OAS1 基因多态性对OAS1蛋白酶抗病毒感染活性影响以及对细胞因子分泌的调节作用，我们猜测它的功能性单核苷酸多态性rs10774671 可能与SPTB 和PPROM 的遗传易感性相关。本研究拟通过病例- 对照研究探讨OAS1 启动子区域内的rs10774671 位点与SPTB 和PPROM 发生的关联性，为早产的早期预测和临床治疗提供有应用价值的遗传标记。 1 资料与方法 1.1 研究对象

从2009 年1 月到2011 年5 月期间在我院新生儿监护病房住院的新生儿中选择病例组和对照组。这些新生儿均来自于北京及其周边地区、在遗传学上无关联的汉族人，排除胎儿畸形、宫内生长受限、子癎、结缔组织病、外伤、出血及任何需要进行引产的疾病。

病例组为胎龄<37 周的599 例单胎出生早产儿，其中PPROM 171 例。根据胎龄的大小，病例组又分为3 个亚组：超早产组（胎龄<28 周；n=28）、极早产组（胎龄<32 周；n=102）、晚期早产组（胎龄≥ 32 周；n=469）。临床检查孕妇阴道有液体流出，阴道液酸碱度测定pH>6.5，显微镜检查阴道液涂于玻片上观察到羊齿状结晶，可诊断为胎膜早破。

对照组的纳入标准为：单胎妊娠；胎龄≥ 37 周；孕母无SPTB 和PPROM 病史。依照纳入标准，对照组共纳入673 例足月儿。 1.2 基因组DNA 的提取及引物设计

采集每个研究对象EDTA 抗凝静脉血2 mL，采用天根生化全血DNA 提取试剂盒，按照操作说明书提取EDTA 抗凝血全基因组DNA，编号后放入-20℃冰箱保存备用。

以Primer Express 3.0 软件设计引物序列。OAS1 基因rs10774671 位点的引物序列：上游引物5'-TCGTCGGTCTCATCGTCTGTACTGTTGCTTTAAGC-3'；下游引物5'-CCCCTACGTGGATCACTCACT-3'。以上引物均由上海生工生物合成。 1.3 应用PCR 的方法扩增目的基因

PCR 的反应体积为25 μL，反应体系为20 ng模板DNA 1 μL，0.2 μM 的上、下游引物各1 μL，2XTaq PCR MasterMix（0.1 U Taq polymerase/μL，500 μM dNTP，20 mM Tris-HCL，100 mM KCL，3 mM MgCl₂）12.5 μL，其余用去离子水补充。扩增OAS1 基因反应条件为：94 ℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，63.5℃退火30 s；72℃延伸45 s；重复12 个循环，72 ℃ 末延伸12 min；94 ℃ 变性30 s，57.5℃退火45 s；72℃延伸45 s；重复20 个循环，72℃末延伸12 min。扩增目的片段长度为：300 bp；PCR 反应后取5 μL 产物，经2.5%~3% 的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像仪下对照DNA MARK ，观察目的片段的扩增是否成功。 1.4 基因多态性分析

采用以PCR 为基础的限制性内切酶片段长度多态性分析进行基因多态性分析，25 μL 酶切反应体系为：PCR 产物15 μL，10× 缓冲液2.5 μL，限制性内切酶（BIOLABS 公司）Hind III 1 μL，其余用纯水补足。该反应体系在37℃酶切过夜，酶切产物10 μL 用2.5%~3% 的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下对照DNA MARK 鉴定酶切片段大小。若该位点为A 等位基因，经Hind III 酶切后，产物为264 bp 和36 bp 两个片段；若为G 等位基因，则切不开，电泳后仅有300 bp 的片段。 1.5　统计学分析

每一个SNP 位点的基因型和等位基因型频率通过记数确定；采用Arlequin 软件检验哈- 温遗传平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE），确定研究样本的群体代表性。采用SPSS 16.0 软件包进行统计学分析与处理。计数资料用频数（百分率）表示，组间比较采用卡方检验。计量资料呈非正态分布，用中位数（四分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）] 表示，采用 Mann-Whitney U 检验。采用卡方检验对OAS1 基因rs10774671 位点的多态性与SPTB 和PPROM 的发生进行风险评估，用所得的比数比（OR）及其95% 的置信区间（CI）表示风险强度。所有的统计检验均为双侧概率，P<0.05被认为有统计学意义。 2 结果 2.1 流行病学资料

以病历和问卷等方法收集全部研究对象的社会人口学资料，见表 1。在母亲年龄、妊娠次数、产次和新生儿性别上，病例组和对照组之间差异无统计学意义，但在胎龄、出生体重、1 min 及5 min Apgar 评分方面，两组间比较差异有统计学意义（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 病例组和对照组的流行病学资料

表 1 病例组和对照组的流行病学资料

排除对照组基因分型失败的19 个样本外，病例组和对照组的实际样本量分别为599 例和654 例。基因型分布均符合哈- 温遗传平衡定律（P>0.05），具有良好的群体代表性。两组OASrs10774671 基因型和等位基因频率的分布见表 2。病例组和对照组的AA、GG、GA 基因型构成比、隐性遗传模式GA+GG 的构成比及等位基因A、G频率之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。由于病例组和对照组比较的卡方检验结果示差异无统计学意义（P>0.05），因此没有必要再计算_OR及其95%CI 来评价风险强度。

表 2(Table 2)

表 2 病例组和对照组 OAS rs10774671 的基因型和等位基因频率 [n（%）]

表 2 病例组和对照组 OAS rs10774671 的基因型和等位基因频率 [n（%）]

有无PPROM 病例组和对照组的AA、GG、GA 基因型构成比、隐性遗传模式GA+GG 的构成比和等位基因A、G 分布频率之间的差异均无统计学意义（P>0.05），见表 3。由于组间比较的卡方检验结果示差异无统计学意义（P>0.05），因此，没有必要再计算OR 及其95%CI 来评价风险强度。

表 3(Table 3)

表 3 有无 PPROM 病例组和对照组 OAS rs10774671 基因和等位基因频率的比较 [n（%）]

表 3 有无 PPROM 病例组和对照组 OAS rs10774671 基因和等位基因频率的比较 [n（%）]

不同胎龄的3 个亚组（超早产组、极早产组、晚期早产组）与对照组的AA、GG、GA 基因型构成比、隐性遗传模式GA+GG 的构成比和等位基因A、G 分布频率之间的差异均无统计学意义（P>0.05），见表 4。由于组间比较的卡方检验结果示差异无统计学意义（P>0.05），因此没有必要再计算OR 及其95%CI 来评价风险强度。

表 4(Table 4)

表 4 3 个 SPTB 亚组和对照组 OAS rs10774671 基因多态性的基因和等位基因频率 [n（%）]

表 4 3 个 SPTB 亚组和对照组 OAS rs10774671 基因多态性的基因和等位基因频率[n（%）]

宫内或全身感染是导致SPTB 和PPROM 发生的重要风险因素^[9]。但是，也有研究表明，无论有无宫内感染，促进分娩的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均可从蜕膜和绒毛膜中分离，而支持妊娠的炎性细胞因子IL-10 在妊娠组织中则很少存在。表明人类妊娠组织细胞因子本身就有着促进炎症反应的倾向，感染只是诱导因素而非必要因素，也就是说并非所有的炎症性早产都是由感染引起的^[10]。

另一方面，妊娠可以看作是母亲的免疫系统对胎儿的免疫耐受，在这一过程中，Ⅰ型辅助型T细胞因子（Th1）和Ⅱ型辅助型T 细胞因子（Th2）发挥免疫调节的作用，它们通过互相平衡制约来维持妊娠^[11]。在母亲- 胎儿界面的分泌物以及血循环中，正常妊娠时，Th2 细胞因子IL-4、IL-6 和IL-10 浓度升高，而Th1 细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度降低；病理性妊娠（如流产、子癎 ）与Th1 细胞因子的浓度升高和Th2 细胞因子的浓度降低有关；发生 SPTB 和PPROM 时，IFN-γ 和TNF-α 等Th1 细胞因子的浓度显著升高，说明细胞因子分泌水平的不平衡，破坏了母亲对胎儿的免疫耐受从而导致SPTB 和PPROM 的发生^[12]。

OAS1 基因的rs10774671 位点是该基因启动子区最重要的功能性单核苷酸多态性之一，其位于OAS1 第5 内含子的最后一位核苷酸，是第7 外显子的一个剪切受体，决定了mRNA 的剪接^{[7, 13, 14]}。该位点通过影响mRNA 剪接而影响产物2',5'-OAS的酶活性，与多种病毒感染性疾病的发生、发展和治疗转归密切相关^{[13, 15]}。而在本研究结果中，干扰素抗病毒蛋白OAS1 rs0774671 位点的AA、GG、GA 基因型、隐性遗传模式GA+GG 的构成比和A、G 等位基因在病例组和对照组的分布规律相似；有无PPROM 病例组分别和对照组比较，上述构成比和等位基因的分布规律也相似。上述结果说明OAS1 基因的 rs10774671 位点与SPTB 和PPROM 的遗传易感性不相关。由于SPTB 的发生和危害与早产儿出生时的胎龄密切相关，本研究将病例组按照不同胎龄分为3 个亚组，探讨OAS1rs10774671 位点多态性和SPTB 之间的联系在不同的胎龄间是否存在不同，结果显示3 个亚组与对照组在OAS1 rs0774671 位点的AA、GG、GA 基因型、隐性遗传模式GA+GG 构成比和A、G 等位基因的分布规律均相似，说明OAS1 基因的 rs10774671位点与3 个SPTB 亚组的遗传易感性均不相关。如前所述，该位点和病毒感染性疾病的易感性密切相关，而与SPTB 和PPROM 的易感性不相关，可能是因为从某种意义上来说，SPTB 和PPROM 的发生更倾向于是一种无感染的炎症性反应，所以两者之间缺乏关联是可以解释的。

另外，OAS1 基因启动子区域内的7 个单核苷酸多态性（rs3741981，rs2057778，rs2285934，rs2285934，rs10774671，rs1051042 ，rs2660，rs7135577）均位于同一个具有重要功能的连锁不平衡区域内，这一区域内的多个单核苷酸多态性可调节细胞因子的平衡，从而影响机体对风疹病毒活疫苗的先天性免疫反应^[7]。SPTB 和PPROM作为复杂性状的疾病，其发生可能与多个基因或一个基因的多个位点的多态性相关，OAS1 基因的rs10774671 位点与rs1051042 和rs2660 位点位于一个紧密型的连锁不平衡区域内，三者具有相似的调节细胞因子分泌的功能，那么这3 个功能性位点的多态性可能协同影响SPTB 和PPROM 的易感性。从本研究的结果来看，单独探讨rs10774671 位点和SPTB 和PPROM 易感性的关系是不相关的，但是并不能完全否定OAS1 基因与SPTB 和PPROM易感性的关系。因此，需要进一步探讨OAS1 基因启动子区域的其他位点与SPTB 和PPROM 的易感性关系，以确定两者之间是否存在关联。