焦虑抑郁是对外部事件或内在想法与感受的一种不愉快的体验，它涉及轻重不等但性质相同相互过渡的一系列情绪，最轻的是不安和担心，其次是心里害怕和惊慌，最重的是极端恐怖，表现形式上包括主观紧张不安的体验、行为上的运动不安以及植物神经唤起症状^[1]。焦虑抑郁情绪的产生受到遗传与环境两方面因素影响^{[2, 3, 4]}。国外有关焦虑抑郁的分子生物学研究发现5-羟色胺转运体启动子区（5-HTTLPR）基因多态性与焦虑抑郁情绪相关，拥有S型等位基因的个体更倾向于有焦虑抑郁的特质^{[5, 6]}。目前，国内对学龄双生子儿童焦虑抑郁有关环境因素报道较多^{[7, 8]}，而与其相关的遗传因素的研究较少。焦虑抑郁是基因与基因协同作用、基因与环境之间相互作用产生的，目前国内相关基因与环境交互作用的深入分析较为匮乏^[9]。本文拟以学龄双生子儿童为研究对象，以5-HTTLPR基因多态性为遗传标记，探讨基因与家庭环境因素对学龄双生子儿童焦虑抑郁的影响。

选取2012~2013年内蒙古呼和浩特市、包头市8~12岁147对双生子儿童（同卵双生子47对；异卵双生子100对）进行问卷调查，其中男136例，平均年龄9.0±1.8岁，女158例，平均年龄8.8± 1.8岁。所有儿童均身心发育正常，无明显的行为心理疾病和精神异常，家中无精神病患者。研究在征得学校、家长、儿童知情同意后进行。

采用Achenbach儿童行为量表（CBCL）^[10]分量表计算焦虑抑郁因子得分，问卷由家长填写，得分越高，表明焦虑抑郁水平越高。

由家长填写家庭一般情况调查问卷，问卷中包括儿童性别、年龄、父母职业及文化程度等一系列家庭一般状况。使用Olson等1981年编制、费立鹏第3次修改的中文版家庭亲密度及适应性量表（FACESⅡ-CV，第3次修订）计算家庭亲密度得分，得分高于65为高亲密度，低于65分为低亲密度^[11]。使用Perris等1980年编制、岳冬梅修订的父母教养方式量表（EMBU）对家庭教养方式进行粗分，经信度和效度检验后认定此量表具有较高的信度和效度及内部一致性^[12]。

所有入组儿童用清水漱口后，采用一次性匙羹塑料吸管勺状端刮取口腔上皮细胞，置于含无水乙醇的离心管中保存。

（1）DNA提取：所有儿童口腔上皮样本统一用TIANamp Swab DNA Kit（TIANGEN BIOTECH, Beijing）试剂盒提取全基因组DNA。（2）基因型测定：上游引物为：5'-GGCGTTGCCGCTCTGAA-TGC-3'；下游引物为：5'-GAGGGACTGAGCTGGAC-AACCAC-3'。聚合酶链式反应（polymerase chian resction, PCR）体系：25 ng模板 DNA 1 μL，Mix 13 μL（包含200 μmol/L dNTPs、2×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl₂、1 U Taq DNA聚合酶），15 ng上、下游引物各0.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s，共34个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物与分型标准物用2%的琼脂糖凝胶电泳，恒定电压为100 V，时间为40 min，经天能凝胶电泳成像系统处理后进行基因型判读，分为3种基因型：SS（484 bp/484 bp）、LS（484 bp/528 bp）、LL（528 bp/528 bp）。

使用Epidate 3.0软件进行双核查录入，采用SPSS 16.0统计软件对结果进行统计学分析，非正态分布的计量资料以中位数（范围）表示，单因素分析时两组间的比较采用Kolmogorov Smirnov Z检验，多组间比较采用Kruskal Wallis H检验，P<0.05为差异有统计学意义。利用广义估计方程（generalized estimating equation, GEE）分析5-HTTLPR 基因型与焦虑抑郁得分的相关性以及单因素分析中具有统计学意义的因素与5-HTTLPR基因型间交互作用对学龄双生子焦虑抑郁因子得分的影响。

从每对双生子中随机抽取一个双生子儿童进行5-HTTLPR基因型的Hardy-Weinberg吻合度检验。结果显示，5-HTTLPR基因型的期望值与观测值吻合较好，符合Hardy-Weinberg平衡定律，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 5-HTTLPR 基因型Hardy-Weinberg 吻合度检验

表 1 5-HTTLPR 基因型Hardy-Weinberg 吻合度检验

利用GEE模型，以编号作为主体变量，出生次序作为主体内变量，选择Unstructure工作相关矩阵。以学龄双生子儿童焦虑抑郁因子得分为因变量，以5-HTTLPR基因型为自变量主效应，选Linear分析方法。结果显示（表 2），儿童焦虑抑郁因子得分与5-HTTLPR基因多态性有显著相关（χ²=3.938，P<0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 5-HTTLPR 基因多态性对儿童焦虑抑郁因子得分的影响

表 2 5-HTTLPR 基因多态性对儿童焦虑抑郁因子得分的影响

以学龄双生子儿童焦虑抑郁因子得分为因变量，以可能影响儿童焦虑抑郁得分的性别、卵型、父母生育年龄、父母职业、家庭亲密度、家庭教养方式等因素为自变量，进行儿童焦虑抑郁因子得分影响因素的单因素分析。结果显示，性别、卵型、父母职业对双生子儿童焦虑抑郁因子得分无显著影响（P>0.05）；父母生育年龄、家庭亲密度、家庭教养方式是双生子儿童焦虑抑郁因子得分高的影响因素（P<0.05）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 影响双生子儿童焦虑抑郁因子得分的单因素分析

表 3 影响双生子儿童焦虑抑郁因子得分的单因素分析

利用GEE模型，以学龄双生子儿童焦虑抑郁因子得分为因变量，以5-HTTLPR基因型、父亲生育年龄、母亲生育年龄、家庭亲密度、家庭教养方式为自变量主效应，选Linear分析方法。结果显示，5-HTTLPR基因型与家庭亲密度（χ²=6.129，P<0.05）和家庭教养方式（χ²=7.665，P<0.05）的交互作用对儿童焦虑抑郁因子得分影响显著（表 4）。从交互作用图上可以看出，在高亲密度家庭中携带S型等位基因的个体焦虑抑郁因子得分显著高于低亲密度家庭（图 1），专制型教养方式的家庭中携带S型等位基因的个体焦虑抑郁因子得分显著高于其他教养方式家庭中的个体（图 2）。提示在高亲密度或专制型家庭环境中S型等位基因可能是双生子儿童焦虑抑郁的风险基因。

表 4(Table 4)

表 4 5-HTTLPR 与家庭环境因素对儿童焦虑抑郁因子得分的影响

表 4 5-HTTLPR 与家庭环境因素对儿童焦虑抑郁因子得分的影响

图 1 5-HTTLPR 基因型与家庭亲密度交互作用对儿 童焦虑抑郁因子得分的影响

图 2 5-HTTLPR 基因型与家庭教养方式交互作用对 儿童焦虑抑郁因子得分的影响

人类5-HTTLPR基因位于5-HTT转录启动部位上游1 kb处，为富含GC的20~30 bp重复元件的重复序列^[13]。5-HTTLPR基因影响到5-羟色胺转运体功能，进而影响5-羟色胺能系统，成为情感、精神和人格障碍及人格特质等研究的热点基因^{[14, 15]}。 本研究发现5-HTTLPR基因与学龄双生子儿童焦虑抑郁水平显著相关，拥有S型等位基因的儿童更倾向于较高的焦虑抑郁水平，与Auerbach等^[16]对两个月大的以色列婴儿研究结果以及Hayden等^[17] 对3~4岁加拿大儿童的研究结果保持一致，提示我国儿童焦虑抑郁的5-HTTLPR风险基因型与国外相似。从神经生理的角度解释，这可能与S型等位基因降低了5-羟色胺转运体对突触间隙5-羟色胺的重吸收水平有关^[18]。

本研究发现，在高亲密度家庭环境中，S型等位基因的作用更加明显。高亲密度主要反映的是缠结型家庭，缠结型家庭的运作规则过分强调情感联接，否认或削弱儿童的独立性意识。家庭人际间界限容易被打破。界限的混乱，父母的干涉过多，控制缺乏灵活性容易导致儿童焦虑抑郁情绪的产生^[19]。父母过度关注儿童发展，使儿童面临较高的学业或生活压力。有报道显示父母的过度保护不仅不会使儿童感到安全反而会让儿童认为自己是易受伤害的且需要保护，容易导致儿童焦虑情绪的产生^[20]。同时，其他相关研究显示家庭亲密度较低时，家庭成员间的感情淡漠缺乏相互关心，儿童的情感需求得不到及时满足，心理容易陷入不安全状态，也会引发焦虑情绪^[21]。提示父母在教育子女时，应该注重儿童的独立意识，恰当的亲密关系可以使儿童在与父母交往时建立富有弹性的自我疆界，理性地支配自己的情绪。亦有报道显示具有同样遗传风险的儿童，低亲密度家庭发生行为问题的概率高于高亲密度家庭，家庭环境因素中高亲密度是保护因素^{[22, 23]}，这与本研究结果不同。不同研究的结果存在差异，其原因可能是：（1）样本来源、研究对象年龄范围不同，本研究的研究对象为学龄期在校儿童，无明显的行为心理疾病和精神异常，其他相关研究的研究对象多集中于婴幼儿期和成年期，而且多以焦虑抑郁患者为调查对象。（2）量表使用不同，本研究焦虑抑郁因子得分来源于CBCL，该问卷由父母填写，其他相关研究对焦虑抑郁的测定多使用自评量表，父母评价可能与自身评价存在偏倚。

此外，家庭教养方式在儿童成长过程中起到重要的作用。良好的教养方式有利于增进父母与子女间的互相理解^[24]。本研究发现，携带S型基因的个体在专制型家庭中更易出现焦虑抑郁问题。专制型家庭主要表现为父母惩罚严厉、过度保护、拒绝否认。父母对孩子的拒绝和控制较多，关心和接受较少，容易导致儿童用消极的观点看待自己的活动和感情，进而产生焦虑抑郁的情绪。国内相关研究结果显示惩罚严厉、过分干涉、过度保护、拒绝否认等教养方式与焦虑抑郁评分存在显著性正相关，其中惩罚严厉、过度保护、拒绝否认对儿童的焦虑抑郁情绪具有预测作用^[25]。改善父母的教养方式可以改善亲子关系，进而改善学龄期儿童处理情绪和问题的方式。因此，对于携带有S型等位基因的儿童，教养时更应注意适度关注儿童的发展，不应过于严格或过于顺从，给儿童以更多自由的空间，从而减少儿童心理行为问题的发生。最近有报道COMT Val158Met基因对儿童攻击行为的影响^[26]、DRD2基因对儿童注意分散度的影响^[27]，均显示基因对个体行为的影响不是绝对的，基因在不同环境因素影响下发挥的作用、程度均不同。儿童焦虑抑郁作为一种情绪表现，是基因与环境共同作用的结果。

本研究以学龄双生子儿童为对象探讨了5-HTTLPR基因与焦虑抑郁的相关性问题，以往研究均以随机抽取每对双生子中的一个个体进入模型进行相关分析，本研究使用GEE模型充分地利用了双生子样本。今后可进一步扩大双生子研究样本，分析SS重合子与LS杂合子之间是否存在差异，是否存在量效关系。对双生子儿童与单胎儿童进行相关横向研究，对其他候选基因和环境因素进行更详细的分析等，深入探讨儿童焦虑抑郁的形成机制。