新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxia-ischemic encephalopathy, HIE）是围生期新生儿常见的中枢神经系统疾病，可以导致严重的神经系统后遗症。但其发病机制尚未完全阐明。Janus激酶-信号转导与转录激活因子（janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT）途径是近年来新发现的一条信号转导途径，该途径可能与脑缺血^{[1, 2, 3, 4]}、神经炎症^[5]等中枢神经系统疾病相关。STAT3 是 STATs 家族的重要成员，能参与信号转导和结合相应DNA位点。当细胞因子与相应的受体结合后，JAKs募集胞浆内的STAT3，使STAT3发生磷酸化而活化。活化的 STAT3 形成同源或异源二聚体转位到细胞核内，与其特异DNA反应元件结合，启动下游靶基因的转录^[6]。研究表明成年鼠脑缺血损伤后，STAT3 的活化形式磷酸化STAT3 （phosphorylated STAT3, p-STAT3）在脑组织中的表达会升高，但p-STAT3在神经细胞上的定位存在差异，一些报道认为 p-STAT3 主要在神经元中表达^{[1, 2]}，而另一些研究则认为 p-STAT3 在反应性星形胶质细胞、小胶质细胞中表达^[7]。另外，缺血性脑损伤时 STAT3 活化的作用也存在争议，有研究发现 STAT3 活化可以上调抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-xl 并下调促凋亡蛋白Bax表达，从而发挥神经保护作用^{[1, 2, 3]}，另有研究认为 STAT3 的过量活化会导致神经细胞凋亡^[4]。不同研究中 p-STAT3 开始出现及达到高峰的时间也不尽相同。上述关于STAT3的研究大都集中在成年鼠脑缺血模型中，而对于STAT3 信号通路在新生鼠脑缺氧缺血性（hypoxia-ischemia, HI）损伤中所起作用报道较少。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是 STAT3 重要的下游效应分子。VEGF 不仅能促进新生血管生成和血管重塑，还是一种重要的神经营养和保护因子^{[8, 9]}，其对中枢神经系统的保护作用已成为研究的热点。尽管有报道称 VEGF 在鼠脑局部脑缺血后表达上调^[10]，但是尚不清楚这种变化是否与 STAT3的活化及神经细胞凋亡相关。

本研究意在阐明 STAT3 在新生鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）中的作用及其与 VEGF 表达、神经细胞凋亡的关系。

山羊血清、SP 免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物公司）；兔抗 STAT3 抗体、兔抗 p-STAT3抗体（Cell Signaling 公司，美国）；兔抗 VEGF 抗体、小鼠抗β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记的抗兔及抗鼠 IgG 抗体（Santa Cruz 公司，美国）； TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（Roche 公司，美国）；酪氨酸磷酸酶抑制剂 Cocktail Ⅱ（Sigma 公司，美国）；BCA 蛋白定量检测试剂盒、牛血清白蛋白（北京百泰克公司）；ECL 底物化学发光试剂（Pierce 公司，美国）。图像采集系统、 CX31 显微镜（Olympus 公司，日本）；ImagePro Plus 4.5 图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）。

7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠共80只（购于华西实验动物中心），雌雄不限，体重11~18 g，随机分为假手术组和HI组，每组40只。

采用Rice-Vannucci法制备HIBD模型^[11]，两组大鼠经乙醚麻醉后取仰卧位固定，颈正中切口，HI组分离并结扎右侧颈总动脉，缝合切口。术后恢复1 h，再将大鼠放入缺氧舱中，充以氮氧混合气（92% N₂、8% O₂）2.5 h，之后取出置于母鼠笼中。假手术组仅予以分离右侧颈总动脉，不予结扎及缺氧处理，其余处理同HI组。

每组按HI后4、6、8、12和24 h 5个时间点取材，每个时间点每组各取8只，然后平均分为两部分，一部分（n=4）于心脏内灌注20 mL生理盐水，4%多聚甲醛内固定20 min，开颅将脑完整取出，分离右侧脑组织，用于苏木精-伊红（HE）染色、免疫组化及TUNEL染色；另一部分（n=4）同上法开颅取脑，在冰袋上分离右侧脑组织，置于液氮中备用于Western blot检测。

在海马层面取材，切片（5 μm）经常规脱蜡水化后，苏木素染色5 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗，伊红染色2 min。脱水、透明、封片。

实验步骤按试剂盒说明进行。一抗滴度为1 : 100（STAT3）、1 : 75（p-STAT3）和 1 : 200 （VEGF）。PBS 代替一抗做阴性对照。在海马层面取材，每个脑组织标本共选取6张切片（5 μm），光镜下每张切片随机选取5个视野（×400）采集图像，应用 Image Pro Plus 4.5 图像分析软件测定蛋白阳性表达的积分光密度（IOD）值。

取冻存脑组织标本50 mg放入细胞裂解液中，匀浆，冰上放置30 min后于4℃、14 000 r/min 离心30 min，收集上清总蛋白。恒压110 V电泳1 h，凝胶转移至固相支持物，膜封闭，ECL显色，凝胶成像仪成像并检测其 IOD 值。目的蛋白条带和内参 β-actin 条带的 IOD 比值表示目的蛋白相对表达量。

按 TUNEL试剂盒操作步骤进行。在海马层面取材，石蜡切片（5 μm）常规脱蜡水化，置于pH 6.0 的柠檬酸缓冲液中，加热30 min，封闭10 min，漂洗后加脱氧核糖核苷酸末端转移酶反应液，37℃ 避光孵育60 min，漂洗后加 Streptavidin-HRP 工作液，37℃避光孵育30 min，DAB显色，阳性细胞显色为棕黄色。每个脑组织标本共选取6张切片，光镜下每张切片随机选5个视野（×400）采集图像，计算凋亡指数（凋亡指数=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%）。

采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

HI 组不同时间点皮层和海马有不同程度细胞肿胀、细胞间隙增宽、细胞排列紊乱、神经元变性、核固缩，HI 后 24 h 细胞缺失明显；假手术组皮层和海马区细胞排列有序，形态正常。见图 1。

图 1 两组新生大鼠各时间点神经细胞病理学改变（HE染色，×400） 假手术组皮层细胞排列有序，形态正常； HI组不同时间点皮层细胞肿胀、细胞间隙增宽、细胞排列紊乱、神经元变性、核固缩，24 h细胞缺失明显。

STAT3 主要分布于皮质和海马区等部位，定位于胞浆及胞核。HI组各时间点STAT3表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；HI组与假手术组比较，各时间点STAT3表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2，表 1。

图 2 两组新生大鼠各时间点STAT3蛋白的表达（免疫组化，×400） 假手术组皮质胞浆及胞核均可见STAT3蛋白表达；HI组各时间点皮质胞浆及胞核STAT3蛋白表达水平与假手术组比较无明显差异。STAT3阳性表达呈棕黄色。

表 1(Table 1)

表 1 两组新生大鼠STAT3蛋白表达水平比较（x ± s）

表 1 两组新生大鼠STAT3蛋白表达水平比较（x ± s）

p-STAT3 分布区域和定位与STAT3蛋白一致。和假手术组相比，HI组大鼠HI后4 h p-STAT3蛋白表达增加，6 h 达高峰，8 h 开始降低，但仍然维持在较高水平（P＜0.05），24 h 降至最低，与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 3，表 2。

图 3 两组新生大鼠各时间点p-STAT3蛋白的表达（免疫组化，×400） 假手术组皮质胞浆及胞核偶见 p-STAT3 蛋白表达；HI组各时间点皮质胞浆及胞核p-STAT3蛋白表达较假手术组显著增加，6 h时表达水平达高峰。p-STAT3阳性表达呈棕黄色。

表 2(Table 2)

表 2 16例患儿MMACHC基因突变检测结果分析（x ± s）

表 2 16例患儿MMACHC基因突变检测结果分析（x ± s）

VEGF主要分布于皮质和海马区等部位，定位于胞浆。和假手术组相比，HI组大鼠HI后4 h VEGF蛋白表达增加，8 h达高峰，12 h开始降低，24 h 降至最低（P＜0.05）。见图 4，表 3。

图 4 两组新生大鼠各时间点VEGF蛋白的表达（免疫组化，×400） 假手术组皮质胞浆偶见VEGF蛋白表达；HI组各时间点皮质胞浆VEGF蛋白表达较假手术组显著增加，8 h时表达水平达高峰。VEGF阳性表达呈棕黄色。

表 3(Table 3)

表 3 两组新生大鼠VEGF蛋白表达水平比较（x ± s）

表 3 两组新生大鼠VEGF蛋白表达水平比较（x ± s）

HI组各时间点凋亡细胞指数均高于假手术组，且随时间延长逐渐增加，24 h时细胞凋亡指数最高（P＜0.01），假手术组各时间点有少量细胞凋亡，见图 5，表 4。

图 5 两组新生大鼠细胞凋亡情况（TUNEL染色，×400） 假手术组偶见TUNEL阳性细胞表达；HI组各时间点神经细胞胞核TUNEL阳性表达较假手术组显著增加，24 h时表达水平最高。TUNEL阳性表达呈棕黄色。

表 4(Table 4)

表 4 两组新生大鼠细胞凋亡指数比较（x ± s）

表 4 两组新生大鼠细胞凋亡指数比较（x ± s）

与假手术组相比，HI后各时间点STAT3蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。p-STAT3 蛋白表达于HI后4 h开始升高，6 h达高峰，8 h以后逐渐降低，除24 h外，HI组各时间点p-STAT3表达均高于假手术组（P＜0.05）。VEGF 蛋白表达于HI后4 h明显增加，8 h达高峰，24 h明显降低，变化趋势与免疫组化结果相似。HI后各时间点VEGF表达均高于假手术组（P＜0.05）。见图 6，表 5。

图 6 Western blot 检测两组新生大鼠STAT3、p-STAT3及VEGF蛋白表达 1为假手术组；2~6分别为HI组HI后4、6、8、12及24 h。

表 5(Table 5)

表 5 Western blot 检测两组新生大鼠各蛋白相对表达水平（n=4,x ± s）

表 5 Western blot 检测两组新生大鼠各蛋白相对表达水平（n=4,x ± s）

JAK-STAT信号通路是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径^{[2, 12]}。在JAK-STAT通路众多分子中，STAT3与神经系统发育和分化密切相关。有研究发现，以成年小鼠脑卒中为研究模型，利用IL-6受体单克隆抗体阻断 IL-6 信号转导后，小鼠大脑皮层缺血半暗带p-STAT3蛋白表达显著减少，梗塞区域凋亡神经细胞明显增多，提示STAT3活化可能具有神经保护作用，从而阻止细胞凋亡^[13]。然而，新生鼠脑HI后STAT3是否活化，以及是否参与损伤神经细胞修复，目前研究甚少。

在本研究中，发现假手术组和HI组STAT3阳性细胞在皮质和海马广泛分布，与既往研究一致^{[1, 2]}；且在假手术组新生大鼠脑组织中p-STAT3蛋白表达水平极低，表明STAT3蛋白主要是以非磷酸化的形式存在于正常新生鼠脑组织中。在HI后4 h p-STAT3蛋白表达增加，6 h达高峰，8 h后降低，p-STAT3阳性细胞主要位于皮质深部及海马，胞质和胞核均有表达，但以胞核表达为主。而STAT3在HI后各时间点表达无差异，提示在HIBD模型中，HI可以诱导STAT3 磷酸化从而激活。Suzuki等^[14]建立成年大鼠大脑中动脉栓塞模型，检测其局灶性脑缺血再灌注损伤后p-STAT3蛋白在脑组织中表达的变化，发现大脑皮质局部缺血再灌注3.5 h后，皮层及纹状体神经元p-STAT3表达水平开始升高，再灌注损伤24 h后p-STAT3蛋白在缺血半暗带区显著增多并达高峰，此后，p-STAT3随着再灌注时间延长表达逐渐减少。其p-STAT3表达趋势与本研究相似，即先升高后降低，但上述研究中p-STAT3表达高峰时间晚于本研究所观察到的时间，这可能与动物年龄及模型不同有关。

作为STAT3重要的下游效应分子之一^[15]， VEGF已被证实可促进缺血区血管再生、结合受体发挥抗凋亡效应、诱导神经干细胞增殖分化成熟^{[9, 16]}。那么在HI后，STAT3活化是否诱导VEGF的表达呢？本研究结果显示，HI后4 h VEGF表达增加，8 h达高峰，之后降低，但假手术组只有少量VEGF表达。以上结果提示新生鼠脑组织发生HI改变后会出现VEGF的表达上调。而另一个值得关注的问题是，HI后p-STAT3表达也呈先升高后降低的趋势，但表达高峰早于VEGF。根据p-STAT3与VEGF表达高峰出现的先后及表达趋势的一致性推断：新生鼠脑HI后，活化的STAT3可能参与了其下游VEGF的表达调控。

本研究凋亡检测发现，凋亡细胞数随HI时间的延长逐渐增加，VEGF的表达变化趋势与凋亡趋势相反，即VEGF表达高时，凋亡程度轻，VEGF下降时，凋亡增加。这可能是由于p-STAT3 蛋白逐渐减少，受其调控的VEGF表达也相应降低，对神经有保护作用的因子下调，导致损伤加重，凋亡细胞增多^{[3, 17]}。其他信号通路，如HIF-1α/caspase-3在新生鼠脑HI中的作用研究也提示上游神经保护因子HIF-1α的表达呈先增加后降低的趋势，而神经细胞的凋亡呈逐渐增加趋势^[18]，与本实验结果类似。因此，推测新生大鼠HIBD时，VEGF表达增加对神经细胞具有保护作用。

综上，HI可激活新生大鼠脑组织STAT信号通路，诱导STAT3磷酸化，调节其下游VEGF蛋白表达，推测STAT3通路激活可能参与了神经细胞的凋亡调节，与神经细胞的凋亡抑制相关。