2016, Vol. 18
2. 厦门市妇幼保健院 医学检验科, 福建 厦门 361003
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）是儿童急性呼吸道感染的常见病原。目前MP感染的诊断主要通过检测血清MP-IgM抗体，但其最佳窗口期为感染后7~10 d左右，不适于早期诊断。被动凝集法能够同时检测MP总抗体（IgG+IgM+IgA），具有精确度高、敏感度高、操作简便的特点，但同样不适于MP感染的早期诊断，更多地用于病例回溯性研究[1]。除此之外，血清学免疫检测还存在特异性低的问题[2]。实时荧光定量PCR检测MP-DNA则不受病程影响[3]，有助于抗体尚未形成患者的早期诊断，亦有助于抗体滴度下降或者已经消失患者的诊断。但MP-DNA检测存在标本难以“标准化”的问题，而肺炎支原体载量指数（Mycoplasma pneumoniae load index,MPLI）作为新的MP-DNA诊断指标较好地克服了这个问题[4]。因此我们检测MP肺炎患儿不同阶段的MPLI与总抗体，评估其在MP肺炎中的诊断价值。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2012年1月至2015年12月厦门市妇幼保健院儿科115例肺炎支原体肺炎住院患儿作为研究对象，其中男67例、女48例，年龄1岁6个月至7岁11个月，平均年龄5.0±1.8岁。同期健康体检儿童400例作为对照组，男225例、女175例，年龄2岁6个月至5岁10个月，平均年龄4.8±1.5岁。根据病程第1周的MP-DNA载量，分为低载量组（MP-DNA拷贝数<103/mL），中载量组（拷贝数103/mL~106/mL），高载量组（拷贝数>106/mL）。根据第1周总抗体检测结果分为抗体阴性组（滴度<1 : 80）与阳性组（滴度≥1 : 80）。本研究获得医院医学伦理委员会批准及研究对象监护人的知情同意。
肺炎支原体肺炎的诊断和疗效判断参照支原体肺炎临床路径[5]。
1.2 MP-DNA定量检测收集患儿及对照组咽拭子用于MP-DNA检测。采样时间分别为入院当天，病程第1、2、4周和第8周。第1次采样前均无抗MP治疗史。
荧光定量PCR检测MP-DNA含量，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。应用ViiA7Dx基因检测系统进行PCR扩增及数据处理，具体按说明书操作。PCR循环条件：93℃2 min，93℃45 s，55℃60 s，共10个循环；93℃30 s，55℃45 s，共30个循环。以H肌动蛋白DNA（H actin-DNA）作为内参，引物、探针由上海英潍捷基公司合成。H actin-DNA引物正向：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'，反向：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，探针序列为：5'-TTCACCACCACGGCCGAGC-3'。H actin PCR循环条件：94℃4min预变性，93℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。计算MP-DNA阳性样本的MP-DNA相对定量值，即MPLI。
MPLI=-lg（MP-DNA拷贝量/H actin-DNA拷贝量）。
1.3 被动凝集法检测MP总抗体采集患儿及对照组非抗凝静脉血，取血清用于MP总抗体检测。采样时间分别为入院当天及病程第1、2、4、8周。第1次采样前均无抗MP治疗用药史。
血清MP总抗体（IgG+IgM+IgA）检测采用被动凝集法，试剂盒采用日本富士瑞必欧株式会社的SE-RODIA-MYCO-Ⅱ型，严格按照说明书进行。
1.4 统计学分析应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析、t 检验。计数资料的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般资料115例肺炎支原体肺炎患儿中男67例、女48例，年龄5.0±1.8岁。400例健康儿童中男225例、女175例，年龄4.8±1.5岁。两组之间年龄、性别构成比差异无统计学意义（t=0.876，χ2=0.582，P>0.05）。
2.2 MPLI的临界值400例健康儿童咽拭子MP-DNA拷贝数为62±13，H actin-DNA的平均拷贝数为（7±4）×108，MPLI为7.0±0.2。根据药监局体外生物诊断试剂申报技术要求[6]计算得出MPLI临界值为6.12，即MPLI>6.12的视为阴性、≤6.12的为阳性。所有肺炎支原体患儿在未予治疗时的MPLI均< 6.12，治愈后MPLI均转阴。
2.3 MP载量和抗体水平的动态变化各载量组的MP-DNA均随着病程而下降，115例MP肺炎患儿随访至第8周时MP-DNA均<1×103/mL；MPLI则随着病程而上升，其中低载量组至第2周即转阴（>6.12），中载量组和高载量组在第8周转阴。MP总抗体滴度随着病程而逐步上升，第4周达最高，第8周有所下降。低载量组的抗体滴度在整个病程中均低于中、高载量组（P<0.05）；中载量组的抗体滴度在前4周低于高载量组（P<0.05），第8周中、高载量组的抗体滴度差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
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表 1 不同载量组MP-DNA拷贝数、MPLI和总抗体滴度水平的动态变化 （x±s） |
2.4 不同MP-DNA载量的MP肺炎热程比较
MP-DNA高载量组的MP肺炎患儿的热程（9.8±2.4 d）较中载量组（6.8±2.9 d）和低载量组（6.4±2.3 d）长（P<0.05），中、低载量组的热程差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 总抗体检测阴性或阳性组的MPLI水平比较根据肺炎支原体肺炎患儿入院第1周的MP总抗体结果分为抗体阳性组和阴性组。在病程前2周，抗体阴性组的MPLI均高于抗体阳性组（P<0.05）；在第4和第8周，抗体阴性组的MPLI虽仍大于抗体阳性组，但差异没有统计学意义（P>0.05）。见表 2。
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表 2 总抗体检测阴性和阳性组的肺炎支原体载量指数比较 （x±s） |
3 讨论
MP感染的诊断一般是采用免疫学方法检测机体产生的IgM、IgG等抗体，而IgM和IgG抗体常常在感染1~2周左右才出现；此外，由于婴幼儿免疫系统发育不完全，感染后抗体生成不足可能导致免疫学检测结果假阴性[7-8]，因此MP抗体检测在婴幼儿MP感染的早期诊断中具有一定的局限性。PCR技术检测MP-DNA具有高度特异性和敏感性[8-12]，使MP的早期诊断成为可能。MPLI则通过引入咽部上皮细胞的看家基因H actin 作内参实现了咽拭子MP-DNA检测的样本“标准化”问题，因为H actin的表达不受环境因素影响[13-14]。因此，通过测定咽部上皮细胞的H actin-DNA表达计算得到的MPLI克服了MP-DNA检测难以“标准化”的问题。
本研究显示，患儿MP总抗体在第1周滴度较低，随着病程进展，抗体滴度水平迅速升高并保持在较高水平，表明血清总抗体检测不适于MP肺炎早期诊断，但在病例回溯性研究有意义。本研究还显示，通过测定咽部上皮细胞的看家基因H actin-DNA表达计算MPLI，得出的MPLI临界值为6.12，与张瑾等的研究相接近[15]。所有患儿在入院当天的MPLI均呈阳性，而且MPLI随着病程而上升即逐渐转阴，MP-DNA载量则随病程而下降。提示MPLI可作为MP肺炎早期诊断的指标，并可通过动态监测以指导治疗调整。结果还显示，MP-DNA载量较高的患儿其抗体滴度也较高，总热程也较长；此外，入院2周内抗体阴性组患儿的MPLI显著高于抗体阳性组，这与类似研究的结果一致[16-19]，提示MP肺炎患儿的MP-DNA载量、免疫应答及临床特征有一定的相关性。
综上所述，本研究引入一个新的肺炎支原体检测指标MPLI，发现了MP-DNA、总抗体滴度和MPLI在MP-肺炎患儿的动态变化规律，为MP肺炎的早期诊断和疗效监测提供了实验基础。
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