2016, Vol. 18
选取2014年1~12月于苏州大学附属儿童医院呼吸科住院的RTIs患儿1 702例为研究对象，其中男1 098例（64.51%），女604例（35.49%），男女之比为1.8: 1；所有患儿年龄在1个月至15岁10个月之间。临床疾病诊断标准依据《诸福棠实用儿科学》第7版。其中 < 6个月618例，6个月~578例，2岁~352例，≥5岁154例。
收集所有患儿临床表现、实验室检测及胸片结果等临床资料。患儿在入院当天或次日采用一次性吸痰管送入鼻腔7~8 cm，利用负压吸引器抽取鼻咽分泌物2~4 mL，标本迅速送实验室处理用于下呼吸道病原检测。本研究经医院伦理委员会同意，采集过程均告知并征得患儿家属同意。
1.2 实时荧光定量PCR -TaqMan探针法检测HRV基因参考GenBank序列数据库中已发表的多株不同HRV的全基因组序列，设计了扩增HRV的基因引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。HRV引物序列：F：5'-TGGACAGGGTGTGAAGAGC-3'；R：5'-CAAAGTAGTCGGTCCCATCC-3'；PROBE FAM-TCCTCCGGCCCCTGAATG-TAMRA。采用天根离心柱膜抽提法提取鼻咽分泌物中的RNA，操作步骤按照说明书上进行。用6-随机引物逆转录合成cDNA。PCR反应体系（25 μL）：cDNA 3 μL，RT缓冲液2.5 μL，25 mM MgSO4 2 μL，dNTP 1 μL，Taq酶0.25 μL，引物F 0.5 μL，引物Probe、R各0.25 μL，另加ddH2O 14.7 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环。根据荧光曲线判定阳性结果。
1.3 HRV-C亚型的鉴定通过NCBI GenBank数据库分析HRV已知衣壳结构蛋白VP4/VP2区域氨基酸序列，设计特异鉴别HRV-C的兼并引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成，其序列为：上游引物F：GGNWWBTCYGATAGGCTHAA；下游引物R：TANBBDGGCCAYTCHCCRTANGC。以HRV-C51阳性株（疾控中心惠赠）为标准品，实时荧光定量PCR扩增HRV-C，反应条件为：95℃ 15 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，50个循环；于80℃时收集荧光。根据相应扩增曲线的Ct值及引物二聚体等确定最佳引物浓度。采用上述确定的最适引物浓度扩增HRV-C51，PCR结束后再行高分辨熔链曲线分析，条件为95℃ 1 min，40℃ 1 min，60℃ 1 s，65℃ 1 s，然后逐步上升到95℃，每隔0.02 s收集1次荧光，最后于37℃冷却1 min。采用仪器自带的软件计算相应扩增产物的熔链温度，以确定HRV-C51的特异性熔链温度，排除引物二聚体等非特异性扩增产物的熔链温度。根据与HRV-C51相应的特征性熔链温度峰确定是否为HRV-C亚型。
1.4 7种常见呼吸道病毒的检测直接免疫荧光法检测呼吸道7种常见病毒：呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、流感病毒A、B型（Inf-A、Inf-B），副流感病毒1、2、3型（Pinf-1~3）。试剂盒购自美国Chemicon公司，根据说明书进行操作，按阳性标准判断结果。荧光显微镜为德国莱卡（020-518.500）。
1.5 人类偏肺病毒、博卡病毒及肺炎支原体检测采用RT-PCR法检测人类偏肺病毒（hMPV），实时荧光定量PCR法检测博卡病毒（HBoV）DNA及肺炎支原体（MP）DNA。取10 μL RT-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察有213 bp荧光片断为hMPV阳性。HBoV阳性根据荧光曲线结果判定，结果以Ct值显示，反应结束电脑自动分析结果，具体步骤按试剂盒（德国QIAGEN公司）操作说明。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测血MP特异性IgM和IgG，试剂购自德国赛润维润公司。若IgM > 1.1 S/CO定为MP急性感染；部分患儿于入院7~10 d后再次采血复查，若第2份血清IgG和/或IgM增高4倍亦定为MP急性感染。具体操作由苏州大学附属儿童医院检验科专业技师完成。
1.6 细菌培养向鼻咽部分泌物中加入无菌生理盐水，充分捣碎后接种在哥伦比亚培养基（血琼脂平板、巧克力平板），置35℃培养箱（5%CO2环境）中进行分离培养18~24 h，根据培养基上菌落特点、革兰染色、显微镜下观察以及生化反应等方法鉴定细菌，人工计数菌落 > 1.0×103/mL为阳性。哥伦比亚琼脂为英国Oxoid公司产品。具体操作及结果判定按标本的细菌学检验程序进行。
1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。非正态分布计量资料以中位数（四分位间距）[P50（P25，P75）]表示，多组比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料以百分率（%）表示，多组比较采用χ2检验、校正χ2检验或Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HRV及HRV-C检出情况1 702例RTIs住院患儿共检出HRV感染244例，阳性率14.34%；HRV-C感染69例，占HRV感染患儿28.3%。
2.2 混合感染的检测结果69例HRV-C感染患儿中，27例为单纯感染，42例为混合感染，混合感染率61%。其中混合病毒感染6例（3例HBoV，1例RSV，1例Pinf-3，1例HBoV+RSV）；混合细菌感染32例，包括混合1种细菌感染23例，混合2种细菌感染8例，混合3种细菌感染1例，以混合肺炎链球菌最常见（9例）；混合肺炎支原体感染26例。
175例HRV-A/B型（非HRV-C型）感染患儿中，42例为单纯感染，其余133例均为混合感染。其中混合病毒感染32例（13例RSV，9例HBoV，4例Pinf-3，1例Pinf-1，1例Inf-A，2例HBoV+RSV，1例HBoV+Inf-A，1例HBoV+Pinf-3）；混合细菌感染78例，以混合流感嗜血杆菌最常见（33例），其次为肺炎链球菌（26例）；混合肺炎支原体感染57例。
2.3 性别分布69例HRV-C感染患儿中，男47例，女22例，男女检出率比较差异无统计学意义（χ2=0.408，P=0.523）。175例HRV-A/B感染患儿中，男114例，女61例，男女检出率比较差异无统计学意义（χ2=0.304，P=0.854）。见表 1。
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表 1 HRV-C与HRV-A/B感染患儿性别分布[例（%）] |
2.4 年龄分布
HRV-C阳性患儿的年龄范围为1个月至11岁3个月，中位年龄为1岁8个月；HRV-A/B阳性患儿年龄范围亦为1个月至11岁3个月，但中位年龄为10个月，与HRV-C组比较差异有统计学意义（Z=2.409，P=0.016）。
HRV-C阳性检出情况： < 6个月组检出21例（3.4%），6个月~组检出19例（3.3%），2岁~组检出24例（6.8%），≥5岁组检出5例（3.2%）。其中2岁~组HRV-C检出率显著高于其他年龄组（P < 0.05），其他年龄组HRV-C检出率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。HRV-A/B阳性检出率在各年龄段组患儿间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
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表 2 HRV-C与HRV-A/B感染患儿年龄分布[例（%）] |
2.5 季节流行分布
HRV-C在每个月份呼吸道感染患儿中均有检出，其中秋季阳性检出率显著高于春、夏、冬三季（P < 0.05），春、夏、冬三季阳性检出率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；HRV-A/B在每个月份均有检出，但各季节阳性检出率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
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表 3 HRV-C与HRV-A/B感染患儿季节分布[例（%）] |
2.6 临床特征
HRV-C感染引起毛细支气管炎15例、支气管肺炎31例、大叶性肺炎12例、哮喘急性发作11例，无上呼吸道感染诊断病例，其中HRV-C感染致大叶性肺炎及哮喘急性发作的发生率显著高于HRV-A/B感染（P < 0.05）；HRV-C感染最主要的临床表现为咳嗽（100%），其他临床表现包括湿罗音（66.7%）、喘息（50.7%）、鼻塞、流涕（46.4%）、发热（43.5%）、气促（23.2%）、胃肠道症状（8.7%）、呼吸困难（5.8%）、紫绀（4.3%），但与HRV-A/B型感染患儿比较差异无统计学意义（P > 0.05）；HRV-C感染患儿血中性粒细胞、CRP升高比例高于HRV-A/B感染患儿（P < 0.05）。见表 4。
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表 4 HRV-C与HRV-A/B感染患儿的临床特征比较 |
3 讨论
急性呼吸道感染是5岁以下儿童的常见病和多发病，也是婴幼儿死亡的首要病因[7]。HRV为无包膜的单股正链RNA病毒，归属于肠病毒属，是引起RTIs的重要病因[1]。HRV按传统的血清分型可分为A和B亚型，随着测序技术及分子分型的应用，还存在与A和B不同的HRV-C亚型。目前文献报导HRV感染病例中1/3以上为HRV-C，大量研究表明，HRV-C比HRV-A/B所致疾病更严重[8-10]，且HRV-C季节分布与HRV-A/B不同，提示HRV-C与其他HRV类型致病机制不同[11-13]，既往研究也表明，冬季HRV-C下呼吸道感染可能需要改变治疗方法[14]，因为缺少足够的流行病学资料，目前这些推测尚不确定。因此，需要一个简单而快速的识别HRV-C的方法来加快HRV-C的流行病学研究。
由于HRV-C不能体外分离培养，分子分型是鉴别HRV-C的唯一方法。为特异性扩增HRV-C，本研究通过NCBI Genbank数据库分析HRV已知衣壳结构蛋白VP4/VP2区域氨基酸序列，获得可特异性扩增的HRV-C保守序列（在HRV-C亚型中保守，同时在HRV-A或HRV-B亚型中具不同程度的保守性），最后选择VP2的氨基未端（氨基酸8-37）作为HRV-C特异性鉴别的靶标，通过对51种已知HRV-C亚型这一段氨基酸对应的核苷酸序列进行进化树分析，HRV-A、HRV-B和HRV-C位于不同的进化分枝上，因此，扩增靶区域具有足够的变异性以区分不同的HRV亚型。该HRV-C亚型鉴定的PCR方法简单、高效、快速，且具有灵敏度高、特异性强、准确率高等优点，具有较好的临床应用价值，但是，HRV变异相当多，目前已有几百种HRV亚型或株报道，PCR方法存在一定的假阳性和假阴性，可后续采用一定量的样本作序列测定，以进一步验证及优化实验诊断。由于尚没有掌握HRV-A/B扩增检测的熔链温度，加之时间仓促，未能行HRV-A/B的检测及序列测定。
大量研究显示，全球范围内，HRV的三种基因型均有流行，流行的基因型因地区、时间的变化而不同，全球各地HRV-C感染率也不同。部分地区HRV-C型占主导地位，如：美国[15]住院及门诊患儿HRV-C检出率分别为8.2%、3.9%，HRV-A检出率分别为8.1%、2.2%，HRV-B检出率≤1%；英国[16]住院患儿HRV检出率为21.5%，其中HRV-A、B、C分别占39.4%、33.9%、42.9%；巴西[17]门诊就诊的喘息儿童患者中HRV-C检出率占总HRV感染患儿的60.7％，在无哮喘史的儿童患者中检出率高达69.6％。而我国北京[18]、兰州[19]、甘肃[20]、长沙[21]、香港地区[22]，及国外新加坡[23]、韩国[24]、西班牙[25]以HRV-A感染占主导地位。本研究244份HRV阳性样本共检出HRV-C 69例，检出率4.05%，占HRV感染的28.3%。不同地区HRV基因型检出阳性率的不同可能与检测方法、受检的人群不同有关。
本研究发现，HRV-C检出高峰在秋季，以2~5岁检出阳性率最高。既往研究表明，HRV感染全年均可发病，但其感染高峰在每年的春秋季，每年的流行时间随地区气候的变化而变化[20]。
HRV-C的流行呈现明显的季节性：澳大利亚McErlean等[8]的研究中显示，HRV-C在春季检出率较高；美国[9]和我国[26]报道在早冬和晚春检出率较高；中国香港[27]、西班牙[28]和日本[12]报道的HRV-C的检出高峰在秋冬季。很少有研究报道不同HRV基因型感染与年龄的关系，然而，泰国一项研究发现[29]，HRV-A感染常见于小于1岁患儿及成年人，而HRV-C在1~4岁患儿检出较多，与本研究HRV-C常见感染年龄相似。2008年儿童支气管哮喘诊断与防治指南[30]指出，早期起病的持续性喘息主要与病毒感染有关，其中 < 2岁的儿童通常与RSV感染有关，而2岁以上的儿童往往与HRV等其他病毒感染有关，提示HRV-C与2~5岁儿童喘息关系密切。
本研究中，HRV-C感染与HRV-A/B感染后临床表现无显著差异，这与美国此前报道一致[31]。HRV-C感染主要引起下呼吸道感染，包括毛细支气管炎、支气管肺炎、大叶性肺炎、哮喘急性发作，其中大叶性肺炎、哮喘急性发作患儿HRV-C检出率显著高于HRV-A/B，提示HRV-C感染所致呼吸道疾病程度较HRV-A/B重，HRV-C感染易致哮喘急性发作。既往也有研究认为，HRV-C更易引起婴幼儿急性呼吸道感染，且大部分是下呼吸道感染，常与持续咳嗽和哮喘急性发作有关[8]。
本文所述HRV-C亚型鉴定的PCR方法简单、高效、快速，且灵敏度高、特异性强、准确率高，具有较好的临床应用价值。研究表明，HRV-C是苏州地区儿童急性呼吸道感染的重要病原体，全年均可检出HRV-C感染，感染高峰在秋季，感染年龄以2~5岁为主，与HRV其他基因型临床症状相似，但HRV-C引起哮喘急性发作和大叶性肺炎比例较HRV其他基因型高，这对指导临床诊疗与预防具有较高的应用价值。为了全面认识HRV-C的流行病学、临床特点，还需要更多深入的研究。
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