早产是一个涉及全球范围的临床医学和公众健康难题，约有70%的早产为自发性早产（spontaneous preterm birth, SPTB），而SPTB中有50%是胎膜早破（premature rupture of membranes, PROM）导致的，又称为早产胎膜早破（preterm premature rupture of membranes, PPROM）。SPTB的病因和发病机制至今仍不明确，然而，许多研究都显示，无论是否有感染发生，SPTB及PPROM都与炎症反应通路上、介导和调节炎症与免疫反应的炎症细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶等炎症介质的变化密切相关^[1-3]。基因多态性位点，主要形式是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP），可能引起DNA结构和基因功能的改变，是导致不同个体间生物学性状（如对疾病的易感性、临床转归和对药物治疗的敏感性等）差异的遗传学基础。SNP作为第三代遗传标记具有分布广泛、遗传稳定、易于高通量检测等优点，适合进行多基因复杂性状疾病的遗传易感性的研究^[4]。SPTB作为一种多基因复杂性状疾病，与其发生相关基因的SNP可以影响SPTB的发生风险，研究SPTB的遗传易感性对于揭示其发病机制，进行早期预防和干预具有重要意义。

白细胞介素-1β（IL-1β）是具有重要功能的炎症细胞因子，通过刺激其他炎症细胞因子、蛋白和粘附分子的产生，从而诱导炎症性反应的发生。当出现宫内感染时，早产孕妇胎膜、胎盘和子宫基层中IL-1β和IL-6的表达水平显著升高^[5]。在体外实验中，将羊膜与TNF-α和IL-1β共同孵育，羊膜的机械强度明显削弱，弹性降低^[6]。Edwards等^[7]发现孕妇宫颈分泌物中IL-1β表达量的增加与SPTB的患病风险的升高密切相关。鉴于IL-1β在SPTB的发生中发挥重要作用，猜测IL-1β基因的C+3953T位点可能与SPTB的遗传易感性相关。

由于基因的SNP存在显著的种族差异性，在不同人群中，IL-1β基因SNP与SPTB遗传易感性关联性研究的结果存在不一致，例如，Yilmaz等^[8]发现在欧洲人群中炎症细胞因子IL-1β基因的SNP与SPTB的遗传易感性显著相关；而Pereyra等^[9]发现拉丁美洲人群中IL-1β基因的SNP与SPTB的患病风险无显著的遗传学关联。因此，国外人群中遗传易感性的研究结果不一定适用于中国人群。本研究首次在中国人群中进行大样本系统的病例-对照研究，探讨IL-1βC+3953T多态性位点与SPTB患病风险的关联性，获得中国人群特异的有应用价值的易感基因和SNP，为SPTB的早期预防、干预及将来可能的个性化基因治疗提供新的标记。

2009年1月至2011年5月和2014年3~9月期间，从收治于北京军区总医院附属八一儿童医院早产儿病房的新生儿中收集EDTA抗凝血样本。

（1）研究对象的纳入标准：来自北京及其周边地区在遗传学上无关联的汉族新生儿；排除胎儿畸形、宫内生长受限、胎儿窘迫、先兆子癎、结缔组织病、外伤、出血及任何可能需要进行引产的围产期并发症。其中病例组纳入标准：单胎妊娠；胎龄 < 37周。病例组按照是否合并PROM，分为有PROM组（PPROM组）和无PROM组；按照SPTB新生儿出生时胎龄的大小，分为3个亚组：超早产组（胎龄≤28周）、极早产组（胎龄≤32周）和轻度早产组（胎龄33~36周）；超早产组和极早产组合并组成重度早产组（胎龄≤32周）^[10-11]。对照组纳入标准：孕母无SPTB或PPROM病史；单胎妊娠；胎龄≥37周。

（2）PROM的诊断标准：孕母阴道有液体流出；阴道液酸碱度测定pH > 6.5；显微镜检查阴道液涂于玻片上观察到羊齿状结晶。

按照研究对象的纳入标准，病例组共纳入753例SPTB新生儿，其中超早产组66例，极早产组198例，轻度早产组489例，PPROM 219例；对照组样本681例。

采用最新的Sequenom MassARRAY^®SNP检测技术（博奥生物集团有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心）对IL-1β基因C+3953T多态性位点进行SNP分型。

采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析与处理。采用Arlequin软件检验哈-温遗传平衡（Hardy-Weinberg equilibrium），确定研究对象的群体代表性。检验病例组和对照组研究对象基线资料的同质性时，计数资料采用χ²检验或Fisher确切概率法进行分析；呈非正态分布的计量资料用中位数（四分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）]表示，采用Mann-Whitney U检验进行分析。

在病例-对照人群中，候选基因每个SNP位点的等位基因和基因型频率通过记数确定，用频数（百分率）表示。并在共显性、显性、隐性、超显性和加性5种遗传模式中进行分析。设A为SNP的高频率等位基因，B为低频率等位基因，则共显性模式以AA基因型为参考，分别进行AB vs AA和BB vs AA的比较；显性模式以AA基因型为参考，进行AB+BB vs AA的比较；隐性模式以AA+AB联合基因型为参考，进行BB vs AA+AB的比较；超显性模式以AA+BB联合基因型为参考，进行AB vs AA+BB的比较；加性模式将AA、AB和BB作为B等位递增的有序变量进行B等位剂量分析。采用χ²检验分析病例组和对照组在单个等位基因、基因型及遗传模式中的分布频率，通过logistic回归分析矫正母亲年龄和婴儿性别后，对每个基因的SNP位点与SPTB发生的关联性进行风险评估，用所得的比值比（OR=）及其95%的置信区间（CI）表示风险强度。所有的统计检验均为双侧概率，P < 0.05被认为有统计学意义。

以病历和问卷等方法收集全部研究对象的流行病学资料，见表 1。在母亲年龄、妊娠次数、产次和新生儿性别上，病例组和对照组之间的差异无统计学意义，但在胎龄、出生体重、1 min及5 min Apgar评分方面，两组之间差异有统计学意义。

表 1

表 1 研究对象的流行病学资料

表 1 研究对象的流行病学资料

对照组和病例组分别有8个样本和26个样本基因分型失败，因此，对照组和病例组的实际样本量分别为673例和727例。病例组和对照组基因型分布均符合哈-温遗传平衡定律（P > 0.05），具有良好的群体代表性。

病例组基因分型结果中不含TT基因型，因此，隐性（TT与CC+CT）遗传模式未计算。两组的IL-1βC+3953T位点等位基因和基因型分布频率见表 2。所有样本中，与对照组比较，T等位基因在病例组的分布频率显著高于对照组（P=0.047），病例组和对照组之间CC、CT、TT基因型的构成比差异有统计学意义（P=0.038）。通过logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，分析共显性（CT vs CC；TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型，CT基因型与发生SPTB的风险升高相关（OR=1.69，P=0.038）；分析显性（CT+TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型来说，T等位型（CT+TT基因型）与发生SPTB的风险升高相关（OR=1.63；P=0.036）；分析超显性（CT vs CC+TT）遗传模式，相对于CC+TT基因型，CT基因型与SPTB的风险升高相关（OR=1.69，P=0.025）；用加性模式进行T等位剂量分析，T等位基因递增与发生的SPTB的风险升高不相关（P=0.053）。

表 2

表 2 病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 2 病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

有PROM组与对照组比较，T等位基因在病例组的分布频率显著高于对照组（P=0.003），病例组和对照组之间CC、CT、TT基因型的构成比差异有统计学意义（P=0.011）。通过logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，分析共显性（CT vs CC；TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型，CT基因型与PPROM的患病风险升高相关（OR=2.45，P=0.011）；分析显性（CT+TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型来说，T等位型（CT+TT基因型）与PPROM的患病风险升高相关（OR=2.36，P=0.005）；分析超显性（CT vs CC+TT）遗传模式，相对于CC+TT基因型，CT基因型与PPROM的患病风险升高相关（OR=2.46，P=0.004）；用加性遗传模式进行T等位剂量分析，T等位基因递增与PPROM的患病风险升高相关（OR=2.19，P=0.009），见表 3。

表 3

表 3 有PROM病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 3 有PROM病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

无PROM组与对照组比较，两组之间等位基因C、T分布频率和CC、CT、TT基因型构成比之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。通过logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，分析共显性（CT vs CC；TT vs CC）、显性（CT+TT vs CC）、超显性（CT vs CC+TT）和加性（T等位基因递增）5种遗传模式，IL-1βC+3953T位点与不合并PROM的SPTB的遗传易感性不相关（P > 0.05），见表 4。

表 4

表 4 无PROM病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 4 无PROM病例组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

不同胎龄的3个亚组（超早产组、极早产组、轻度早产组）分别与对照组比较，其中超早产组和极早产组与对照组的等位基因T、C分布频率和CC、CT、TT基因型构成比之间的差异均无统计学意义（P > 0.05）。通过logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，分析共显性（CT vs CC；TT vs CC）、显性（CT+TT vs CC）、超显性（CT vs CC+TT）和加性（T等位基因递增）5种遗传模式，IL-1βC+3953T位点与超早产和极早产的遗传易感性均不相关（P > 0.05），见表 5~6。

表 5

表 5 超早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 5 超早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 6

表 6 极早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 6 极早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

轻度早产组中T等位基因分布频率显著高于对照组（P=0.029）；CC、CT、TT的分布频率与对照组有显著性差异（P=0.029）。通过logistic回归分析校正母亲年龄和胎儿性别后，分析共显性（CT vs CC；TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型，CT基因型与发生轻度早产的风险升高相关（OR=1.85，P=0.014）；分析显性（CT+TT vs CC）遗传模式，相对于CC基因型，T等位型（CT+TT基因型）与发生轻度早产的风险升高相关（OR=1.79，P=0.022）；分析超显性（CT vs CC+TT）遗传模式，相对于CC+TT基因型，CT基因型与发生轻度早产的风险升高相关（OR=1.86，P=0.015）；用加性遗传模式进行T等位剂量分析，T等位基因递增与发生轻度早产的风险升高相关（OR=1.70，P=0.033），见表 7。

表 7

表 7 轻度早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

表 7 轻度早产组和对照组IL-1βC+3953T位点的等位基因和基因型频率[n（％）]

本研究探讨了中国人群中IL-1β基因C+3953T位点与SPTB遗传易感性之间的关联性。在所有样本中，携带+3953T等位基因和+3953CT基因型（因为病例组不含TT基因型，所以T等位型仅为CT基因型）的新生儿发生SPTB的风险升高。通过是否合并PROM，将病例组进行分层研究，发现携带+3953T等位基因和+3953CT基因型的新生儿发生PPROM的风险升高。进一步根据出生胎龄的不同将病例组分成3个SPTB亚组，分别与对照组进行比较，发现+3953T等位基因和+3953CT基因型可显著增加轻度早产的患病风险。上述结果初步证实了IL-1β在SPTB及PPROM的发病机制中具有重要的作用，IL-1βC+3953T位点可用来鉴别发生SPTB的高危人群，从而达到预防SPTB发生的目的，有助于明确SPTB的病因和发病机制。

PROM是指在足月分娩之前发生的胎膜破裂，有1%~4%的分娩可并发PROM。多种机制和途径均可导致SPTB的发生，其中PROM是导致SPTB发生的主要原因^[10]。PROM通常与细菌感染的风险增加有关，细菌及其内毒素可诱导宫内炎症反应的发生，与Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）结合后，使宫颈、胎盘、胎膜和子宫肌层等妊娠组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达量增加^[12]，这些细胞因子可刺激宫颈、胎膜和子宫肌层中的PG、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）和前列腺素F2α（prostaglandin F2α, PGF2α）的合成和释放^[13]，而PG可以诱发子宫的收缩和促进宫颈的成熟，对分娩的启动具有重要的意义^[14]。若这一过程被过早激活，就可导致SPTB的发生。而IL-1β既可以直接刺激羊膜，促进羊膜细胞合成PGE2，也可以通过提高子宫肌层中促分娩介质环氧酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）的表达水平，来进一步增加PG的合成^[15]，从而诱发子宫的收缩，导致SPTB的发生。IL-1β表达水平的升高与炎症反应、PPROM和SPTB的发病机制密切相关，因而，IL-1βC+3953T位点与PPROM的遗传易感性相关是有充分的生物学证据支持的。

近年来，大量的证据表明，编码与炎症反应相关细胞因子基因的SNP与SPTB的遗传易感性之间的关联性^{[7, 9, 16]}。众所周知，IL-1β是炎症反应的重要调节因子，与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关^[17]。编码IL-1的基因簇位于2q13-21上，长度约为430 bp，包括编码IL-1α、IL-1β和IL-1RN的基因。其中，IL-1βC+3953T位点位于IL-1β基因的第5外显子上，对IL-1β表达水平的调节具有重要的意义。在体外实验中，IL-1βC+3953T位点的C被T取代后形成的次要等位基因IL-1β+3953*2（T等位基因）与IL-1β的表达水平增加有关^[18]。Yilmaz等^[8]的研究发现：在欧洲人群中，当携带IL-1β基因C-511T位点TT基因型的母亲怀有-511CT基因型的胎儿时，发生SPTB的风险显著升高。在本研究人群中，携带+3953T的SPTB新生儿比例显著高于足月新生儿，考虑到IL-1β表达量的升高可增加SPTB的患病风险，携带+3953T等位基因的个体可表达更多的IL-1β，因而对SPTB具有更高的易感性。

考虑到SPTB的发生及其并发症的严重程度与早产儿出生时的胎龄密切相关，本研究通过3个不同胎龄的SPTB亚组分别与对照组比较，发现此SNP位点与发生轻度早产的风险升高显著相关。已有研究者发现，基因的SNP与SPTB遗传易感性之间的关联性会受早产儿出生胎龄的影响^[19]。因此，此位点仅影响轻度早产的患病风险是合理的。然而，鉴于超早产组的样本量（n=61）较少，研究结果需要进一步的验证。

本研究结果对于预测SPTB的发生风险有一定的提示作用，携带+3953CT基因型的个体SPTB的发病风险是CC基因型携带者的1.63倍。在中国人群中，筛查IL-1βC+3953T位点的易感等位基因和基因型有助于鉴别SPTB高危人群和预防SPTB的发生。然而，SPTB属于多基因调控的具有复杂性状的疾病，易感基因之间、易感基因的SNP位点之间甚至环境因素和易感基因的SNP位点之间的相互作用均可以影响SPTB的患病风险。因此，在下一步的研究中，实验设计应包含多种易感基因和易感基因的多个SNP位点，这样可以更好地阐述基因的SNP与SPTB的遗传易感性之间的关系，更为准确地预测SPTB的发生。