2016, Vol. 18
2. 暨南大学附属第一医院眼科, 广东 广州 510630
Alagille综合征（Alagille syndrome, ALGS）是一种常染色体显性遗传病, 主要累及肝脏、心脏、脊柱、眼、颜面和肾脏等多器官[1-2]。绝大多数ALGS由JAG 1基因突变所致，称为ALGS I型；也有小部分是由于NOTCH 2突变引起，称为ALGS II型[3]。JAG 1基因定位于染色体20p12，全长36 kb，包含26个外显子，编码细胞膜表面蛋白JAGGED1[4]。JAGGED1是Notch信号通路的一个功能性配体，两者结合后可启动细胞内下游信号转录，影响细胞的增殖与分化，从而调节心脏、肝脏、骨骼、眼睛及面部等组织器官的生长发育[5-6]。
ALGS于1969年由Alagille等[7]首次报道。1997年Li等[8]发现JAG 1基因突变可导致ALGS。目前已报道JAG 1基因编码区突变类型500余种，包括错义突变、无义突变、缺失突变、以及剪接突变等[9]。ALGS患者在波兰、澳大利亚、墨西哥、越南、意大利、日本等不同种族中均有发现[10-15]。国外文献估计ALGS发病率超过1/30 000[16]，但我国人群本病流行病学特点尚不清楚。近来国内课题组积极开展ALGS诊治研究，并在JAG 1基因突变的识别方面取得可喜进展[8, 17-19]。但从总体上讲，本病分子诊断和临床管理经验仍需要进一步积累。本文报道1例ALGS患儿的临床特征和JAG 1基因突变特征，为本病确诊提供分子依据，并为后续的诊治研究提供参考。
1 资料与方法 1.1 病例介绍患儿，男，2岁9个月。因发现肝功能异常及心脏杂音2年余入院。患儿2个月因皮肤巩膜黄染在当地医院就诊，体检发现皮肤巩膜黄染和心脏杂音，但肝脾不大；当时肝功能（见表 1）：总胆红素（Tbil）281.0 μmol/L，结合胆红素（Dbil）169.1 μmol/L，非结合胆红素（Ibil）111.9 μmol/L，ALT 242 U/L，AST 173 U/L，GGT 233 U/L；以“婴儿肝炎综合征、先天性心脏病”住院，给予护肝、利胆等治疗（具体不详）29 d，皮肤、巩膜黄染减轻，但酶学增高未改善。3月龄时外院心脏彩超发现房间隔缺损（静脉窦型）和左肺动脉狭窄，考虑婴儿肝病综合征合并先心病，予护肝、降酶、利胆等治疗，疗效欠佳。1岁3个月在该院行房间隔修补+左肺动脉狭窄矫正术，术前胸片提示第6、8胸椎椎体骨质不连续，呈左右两半，即“蝴蝶椎”畸形（图 1）；术后复查肝功能：Dbil稍高，而Tbil和Ibil正常，但ALT、AST、GGT等仍升高。出院后多次复查肝功能（见表 1）：Tbil稍高（最高54.7 μmol/L）、ALT波动于136~450 μmol/L、AST波动于117~342 μmol/L、GGT波动于760~1 710 μmol/L，心脏杂音未消失。为明确病因至我院儿科就诊。患儿自起病以来，精神食欲可，大小便无异常。
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图 1 患儿1岁3个月的胸椎正位片 T 6、8骨质不连续，呈左右两半，为典型蝴蝶椎畸形。 |
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表 1 患儿历次生化检查结果 |
患儿系第1胎第1产，出生胎龄36周，经阴道分娩出生，出生体重2.2 kg（ < -3 SD），身长47.0 cm（正常），出生时无窒息史。父母体健，非近亲结婚。否认家族类似病史及传染病史。患儿体格及运动发育落后于同龄儿，1岁10个月方独站，2岁3个月独走。
体格检查：体重11.4 kg（ < -3 SD），身长85.0 cm（ < -3 SD），头围48.0 cm（正常）。皮肤巩膜未见黄染，未见皮肤出血点、肝掌及蜘蛛痣，浅表淋巴结无肿大。前额突出，鼻梁低平，小下颌。双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏，左眼内斜视。咽无充血。双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音。心率98次/min，律齐，心音有力，胸骨左缘2~3肋间可闻及2/6级收缩期杂音。腹平软，肝、脾未触及，肠鸣音可。四肢活动自如，肌张力无异常。腹壁、膝腱和跟腱等生理反射可引出，克氏、布氏和巴氏征均阴性。
辅助检查：血常规基本正常。生化检查发现肝功能显著异常（见表 1），电解质正常，但血清锌11.3 μmol/L（参考值：11.47~25.5 μmol/L）。25-羟维生素D3 13.8 ng/mL（参考值：30~100 ng/mL）。血清铁蛋白、甲胎蛋白、粪便及尿常规均未见异常。患儿及其父母的SLC25A13基因高频突变筛查未发现c.851del4，c.1638-1660dup，IVS6+5G > A和IVS16ins3kb等突变类型，结合临床和其它实验室结果，可排除希特林缺陷病。
1.2 JAG1基因突变分析和测序用DNA Mini kit试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）提取患儿及其父母基因组DNA，并用PCR试剂盒（Finnzymes Oy公司，芬兰）扩增患儿及其父母JAG 1基因的所有外显子及其侧翼序列。引物（表 2）根据JAG 1基因的DNA序列使用Primer 5.0软件设计，由英潍捷基贸易有限公司合成。
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表 2 JAG1基因26个外显子扩增引物 |
PCR扩增条件为94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，50~55℃退火40 s，72℃延伸50 s，35个循环，最后再72℃延伸10 min。聚合酶链反应产物经1.5%琼脂凝胶电泳纯化，目标条带送英潍捷基（上海）有限公司进行DNA测序。应用Chromas软件对测序结果进行分析，并应用DNAMAN软件与JAG 1基因组参考序列（Ensemble genome browser: ENST00000254958）进行比对，根据人类基因组变异协会（http://www.ensembl.org）进行突变命名。突变结果均进行DNA双向测序和独立重复试验证实。
本研究获医院医学伦理委员会批准及患儿家长知情同意。
2 结果 2.1 遗传学分析Sanger测序发现（图 2），患儿JAG 1基因外显子20存在一个突变c.2419delG（p.Glu807AsnfsX819），其母亲和父亲JAG 1基因均未检测到该突变。该突变为JAG 1基因2 419位鸟嘌呤缺失而造成移码，致使第807位氨基酸由谷氨酸变为天冬酰胺，并在第819位形成终止密码，理论上产生一个截短蛋白p.Glu807AsnfsX819。该突变在千人基因组计划中频率为0.02%（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?searchType=adhoc_search & type=rs & rs=rs564566567）。检索中国知网、万方、维普和美国Pubmed等国内外文献数据库，未发现关于该突变的正式文献报道。以Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）和PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvaard.edu/pph2/）软件预测该突变的致病性，概率值分别为1和0.930，说明该突变具有致病性。
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图 2 患儿及其父母JAG1基因Sanger测序结果 患儿JAG1基因检出c.2419delG突变（箭头所示），其父亲和母亲相应位置（箭头所示）均为野生型。 |
2.2 治疗与结局
患儿以肝功能异常和心脏杂音查因收住儿科。眼科会诊发现左眼内斜15°，双眼球外转明显受限，内转时眼球后退，眼裂缩小；未见角膜后胚胎环，眼内压测定正常，直接眼底镜检查无异常，诊断为眼球后退综合征（Duane retraction syndorme, DRS）。给予还原型谷胱甘肽等护肝，补充维生素A、D、E和锌等对症支持治疗，病情稳定。根据患儿临床特点及基因测序结果，以“Alagille综合征，眼球后退综合征，锌缺乏症”出院，并定期随访。目前患儿4岁2个月，体格和智力发育正常，无黄疸、肝大和腹水，以及心脏功能不全等临床表现，但面部畸形、左眼内斜视、心脏杂音和肝功能异常持续存在，其远期预后有待长期随访观察。
3 讨论ALGS经典诊断标准为同时满足慢性胆汁淤积、先天性心脏病（肺动脉分支和肺动脉瓣狭窄）、眼部异常（角膜后胚胎环）、脊柱畸形（蝴蝶椎或半椎体）和特殊面容（前额宽阔、眼窝深陷、眼距增宽、尖下巴等）等5个主要临床特征[20]。为避免漏诊和误诊，ALGS修订诊断标准纳入了肝脏病理、肾脏表现、家族史和基因突变等诊断依据；若未进行肝活检，或肝活检未见小叶间胆管数量减少或缺如，但符合包括肾脏表现在内的4个或以上主要特征，亦可诊断为ALGS；若有家族史或检测到JAG 1基因突变，1个或以上主要临床特征即可确诊[20-21]。本研究患儿临床表现为慢性胆汁淤积、蝴蝶椎、房间隔缺损（静脉窦型）和左肺动脉狭窄，以及前额突出、鼻梁低平、小下颌等特殊面容，符合ALGS肝脏、心脏、脊柱异常和特殊面容的特征，且JAG 1基因分析发现突变，ALGS诊断可以确定。
值得注意的是，该患儿虽然没有角膜后胚胎环等ALGS常见眼科体征，但存在明显左眼内斜，经眼科专家会诊，诊断为DRS。DRS病因不详，主要临床特点为眼球运动受限，内转时眼球后退，同时向上或向下偏斜，眼裂变小，少数伴有听力缺陷、耳畸形、宽眼距及脊柱和骨骼畸形等其他系统的先天性发育异常[22]。ALGS可累及眼部，且眼部表现具有高度变异性，如角膜后胚胎环、虹膜发育不良、视杯异常、脉络膜视网膜皱褶、视网膜色素异常，以及角膜病变等[23]；但未见ALGS合并DRS的文献报道。本文患者DRS是ALGS的眼科表现，还是与ALGS偶合出现，有待进一步研究总结。
JAGGED 1蛋白的胞外部分含有4个模体（motif）结构，在NOTCH信号通路的配体-受体相互作用中发挥重要作用。这4个模体结构包括1个N端信号肽、一个高度保守的DSL结构域、1个含16个表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGF）样结构的重复序列，以及1个富含半胱氨酸区域。重复序列中每个EGF样结构包含6个半胱氨基酸残基，残基间通过二硫键维持JAGGED 1蛋白的稳定性[4]。本研究患儿JAG 1突变c.2419delG产生截短蛋白p.Glu807AsnfsX819，将改变重复序列区第15个EGF样结构的氨基酸序列，并造成第16个EGF样结构以及其后富含半胱氨基酸区域的完全缺失，致使JAGGED 1蛋白胞外部分结构完整性受损，严重影响NOTCH信号通路的配体-受体相互作用，最终出现ALGS的一系列临床表现。Crosnier等[24]认为由JAG 1基因突变所致的ALGS中，偶发突变为其主要病因；Li等[8]也提出ALGS患儿的偶发突变率可达87.3%。本例患儿父母未检测到JAG 1基因新突变c.2419delG，也没有ALGS相应的临床表现，提示该患儿该突变可能为偶发突变；此外，本患儿父母一方为生殖细胞嵌合体的可能性也不能完全排除[9]。
总之，本研究系统分析了1例ALGS患儿的临床特征和遗传学特点，发现患儿JAG 1基因存在一个新突变c.2419delG，从而为ALGS确诊提供了分子依据，同时首次在ALGS患儿中发现DRS表现。本研究扩展了ALGS基因突变谱，丰富了其临床表现，对于本病患儿的诊断和治疗具有一定的参考价值。
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