2016, Vol. 18
2. 解放军陆军总医院八一儿童医院新生儿重症监护中心, 北京 100700
胎儿生长受限（fetal growth restriction, FGR）是指出生体重小于同胎龄新生儿出生体重的百分之十的新生儿，生后容易出现短期和长期的神经发育障碍，主要缺陷表现在记忆、识别、视觉空间感知、行为以及注意力等方面。由于FGR患儿神经发育缺陷会对个人生活质量产生深刻影响，因此也受到了越来越多的关注[1-2]。相关研究表明，FGR可能导致大脑神经干细胞表达以及分化发生改变，FGR患儿在出生时，由于海马神经元、星形胶质细胞跟未成熟的少突胶质细胞的比例发生了改变，从而导致缺陷的发生[3-4]。牛磺酸是胎儿和新生儿必须氨基酸，本课题组前期研究显示，牛磺酸能够抑制脑细胞凋亡、促进神经干细胞增殖；激活蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白（protein kinase A-cAMP response element binding protein signal pathway, PKA/CREB）通路及抑制Ras同源基因/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming proteinkinase, Rho/ROCK）通路促进FGR新生鼠脑发育及脑保护作用[5-7]，但是能否通过Rho家族因子促进神经干细胞的增殖尚不明确。为此，本研究拟通过全程饥饿方法建立FGR模型，探讨产前补充牛磺酸是否能够通过调节Rho家族因子活性而促进FGR新生鼠神经干细胞的增殖，为产前补充牛磺酸促进FGR胎儿脑发育提供进一步的理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器牛磺酸颗粒（北京奥博星生物有限公司）；兔抗脂肪酸结合蛋白7（fatty acid binding protein 7, FABP7）、ROCK2、Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A, RhoA）、β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔多克隆抗体（abcam公司，美国）；即用型SABC-POD（山羊IgG）试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzi-dine, DAB）显色试剂盒（黄）（武汉博士德生物工程有限公司）；蛋白质marker（Thermo科技有限公司，立陶宛）；RIPA裂解液、PMSF（南京碧云天公司）；反转录试剂盒（Fermentas公司，立陶宛）；PV-9000免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；2SYBR® Green Realtime PCR Master Mix试剂（TOYOBO生物公司，日本）；显微镜（尼康公司，日本）；病理切片机（Leica公司，德国）；凝胶成像分析系统（BIV-RAD公司，美国）、超速低温离心机（Sigma公司，美国）。
1.2 实验动物分组与模型建立健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌性24只，雄性12只，体重250~300 g，予标准大鼠颗粒饲料和充足饮水喂养（动物与饲料均购于解放军医学院实验动物中心）。每晚将雌雄大鼠以2 : 1合笼，次日晨取阴道分泌物镜检，以发现精子之日为妊娠第0天，受孕后随机分为对照组、FGR组和牛磺酸组，每组8只孕鼠。对照组妊娠期摄取足够饲料，记录当日消耗饲料重量。参考文献[8-9]通过全程饥饿法建立FGR模型。牛磺酸组自建立模型一周后开始在孕鼠饲料中添加牛磺酸[每日300 mg/kg]，直至自然分娩。FGR的判断标准：各组孕鼠自然分娩后，电子天平称量新生鼠体重，精确到0.01 g，以低于对照组新生鼠平均体重的2个标准差定义为FGR。
1.3 取材每组新生鼠生后立即称体重及脑重。各组用随机数字表法抽取10只新生鼠，将其脑组织完整固定于4%多聚甲醛4℃过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行厚约4 μm冠状面连续切片用于免疫组化法。同时，各组随机选取6只新生鼠大脑组织置于-80℃下冻存，用于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）检测。
1.4 RT-PCR检测FABP7、RhoA、ROCK2、rac mRNA表达每组每只新生鼠取大脑组织约100 mg裂解，提取纯化总RNA，用273BR02588型核酸蛋白分析仪（BIO-RAD）进行定量，按照试剂盒说明书（Promega, A3500）进行逆转录操作。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，经基因库检索验证且与其他基因无高度同源性，由上海生工生物技术工程公司合成，引物序列见表 1。PCR反应体系（20 μL）：2×SG Green qPCR混合液10 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、荧光染料0.4 μL、脱氧核糖核酸1 μL、蒸馏水7.8 μL。PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，不同退火温度[RhoA 60℃、FABP7 60℃、ras相关的C3肉毒素底物（ras-related C3 botulinum toxin substrate, rac）56℃、ROCK2 50℃，GAPDH 52℃]退火30 s，72℃延伸32 s，40个循环。以各组新生鼠脑组织FABP7、ROCK2、RhoA、rac mRNA扩增产物的积分吸光度值与GAPDH的比值作为FABP7、RhoA、ROCK2、rac mRNA的表达水平。
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表 1 引物序列 |
1.5 Western blot法检测FABP7、RhoA、ROCK2表达
每组每只新生鼠取大脑组织约0.2 g，液氮研磨，加入细胞裂解液0.5 mL提取总蛋白，提取前加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。4℃15 300转/min离心30 min。取2 μL蛋白粗提液，Bradford方法蛋白定量。配胶上样、电泳，无蛋白快速封闭液封闭；加入FABP7、RhoA、ROCK2抗体（1 : 1 000）4℃过夜，之后加羊抗兔HRP标记IgG或羊抗小鼠HRP标记IgG（1 : 3 000）孵育1 h，洗涤。ECL发光液，暗室曝光检测FABP7、RhoA、ROCK2表达，扫描保存为jpg文件，进行灰度分析。FABP7、RhoA、ROCK2灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
1.6 免疫组化法检测FABP7光密度值每个大脑组织标本随机取3张切片，切片常规脱蜡入水，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，高压锅高压抗原修复3 min，3%过氧化氢滴加于切片组织上以封闭内源性过氧化物酶，室温孵育10 min；滴加小鼠抗FABP7单克隆抗体（1 : 300），4℃孵育过夜；加入羊抗小鼠IgG 37℃孵育30 min；吸水纸吸干切片周围的液体后滴加辣根过氧化物酶复合物37℃孵育30 min。以上各步间均用0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；DAB显色15 s，苏木素复染30 s左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用PBS液水洗返蓝。梯度脱水、透明、中性树胶封片。FABP7主要表达在细胞质中，呈棕褐色，目前被认为是神经干细胞最具特异性的胞内标记物。以PBS代替一抗作阴性对照。每张切片在侧脑室管膜下区（subventricularzone, SVZ）等相应部位随机取10个视野，于400倍光镜下观察阳性细胞分布并计数。
1.7 统计学分析采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以百分率（%）表示，多组间比较采用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组新生鼠出生体重及脑重的比较记录下对照组所有新生鼠的体重，以体重小于5.6 g（小于对照组平均体重的两个标准差）定义为FGR，对照组及FGR组中死胎及死产分别为6只及2只，新生鼠脑重中存在8个缺失值，进行缺失值处理。对照组共分娩新生鼠67只，死亡6只，FGR发生率为0；FGR组共分娩新生鼠65只，其中FGR新生鼠57只，死亡2只，FGR的发生率为88%；牛磺酸组共分娩新生鼠66只，FGR新生鼠32只，FGR的发生率为48%；成功建立FGR模型，且牛磺酸组FGR的发生率较FGR组明显下降（P < 0.05）。对照组、FGR组、牛磺酸组新生鼠之间的体重、脑重及脑重体重比差异有统计学意义（P < 0.05）；FGR组新生鼠体重、脑重明显低于对照组（P < 0.05）；牛磺酸组新生鼠体重、脑重低于对照组（P < 0.05），但高于FGR组（P < 0.05）；FGR组新生鼠脑重体重比高于对照组（P < 0.05）；牛磺酸组新生鼠脑重体重比高于对照组及FGR组（P < 0.05）。见表 2。
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表 2 各组新生鼠一般情况比较 |
2.2 免疫组化法检测各组新生鼠脑组织SVZ区FABP7的表达结果
对照组、FGR组及牛磺酸组新生鼠脑组织SVZ区FABP7阳性细胞的OD值比较差异有统计学意义（P < 0.05）。其中FGR组新生鼠脑组织中FABP7阳性细胞OD值低于对照组（P < 0.05）；牛磺酸组FABP7阳性细胞OD值较FGR组及对照组均增高（P < 0.05）。见图 1，表 3。
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图 1 免疫组化法检测各组新生鼠脑组织SVZ区FABP7阳性细胞分布（DAB，×400） A：对照组SVZ区可见密集分布的FABP7阳性细胞；B：FGR组SVZ区可见散在分布的FABP7阳性细胞；C：牛磺酸组SVZ区可见最为密集分布的FABP7阳性细胞。FABP7阳性表达主要位于细胞质中，呈棕褐色。 |
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表 3 各组新生鼠脑组织中FABP7的表达比较(x±s) |
2.3 RT-PCR检测各组新生鼠脑组织中FABP7 mRNA表达结果
各组新生鼠脑组织中FABP7 mRNA表达差异有统计学意义（P < 0.05）。其中FGR组新生鼠脑组织FABP7 mRNA表达较对照组降低（P < 0.05）；补充牛磺酸后，牛磺酸组新生鼠脑组织FABP7 mRNA表达水平高于对照组及FGR组（P < 0.05）。见表 3。
2.4 Western blot检测各组新生鼠脑组织中FABP7蛋白的表达各组新生鼠脑组织中FABP7蛋白表达结果差异有统计学意义（P < 0.05）。其中FGR组FABP7蛋白表达量较对照组减少（P < 0.05）；补充牛磺酸后，牛磺酸组中FABP7蛋白表达量较FGR组显著增加（P < 0.05），但与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 2，表 3。
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图 2 Western blot检测各组新生鼠脑组织中FABP7蛋白表达水平变化 上图为各组FABP7蛋白电泳条带图；下图为各组FABP7蛋白表达水平统计图（n=6）。a示与对照组相比，P < 0.05；b示与FGR组相比，P < 0.05。 |
2.5 RT-PCR检测各组新生鼠脑组织中RhoA、ROCK2、rac mRNA的表达结果
各组新生鼠脑组织RhoA、ROCK2、rac mRNA表达差异有统计学意义（P < 0.05）。其中，FGR组RhoA、ROCK2 mRNA表达较对照组明显增高（P < 0.05）；予以补充牛磺酸后，新生鼠脑组织RhoA、ROCK2 mRNA低于FGR组，但仍高于对照组（P < 0.05）。FGR组中rac mRNA较对照组明显降低（P < 0.05），予以补充牛磺酸后，新生鼠脑组织rac mRNA表达水平高于FGR组及对照组（P < 0.05）。见表 4。
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表 4 各组新生鼠脑组织RhoA、ROCK2、rac mRNA表达水平比较（x±s） |
2.6 Western blot法检测各组新生鼠脑组织中RhoA、ROCK2蛋白的表达情况
各组新生鼠脑组织RhoA、ROCK2蛋白表达差异有统计学意义（P < 0.05）。其中FGR组RhoA、ROCK2表达水平较对照组明显增高（P < 0.05）；牛磺酸组新生鼠脑组织RhoA、ROCK2表达较FGR组降低（P < 0.05），稍高于对照组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 3，表 5。
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图 3 Western blot检测各组新生鼠脑组织中RhoA和ROCK2的蛋白表达 A图为各组RhoA蛋白电泳条带图及RhoA蛋白表达水平统计图（n=6）；B图为各组ROCK2蛋白电泳条带图及ROCK2蛋白表达水平统计图（n=6）。a示与对照组相比，P < 0.05；b示与FGR组相比，P < 0.05。 |
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表 5 各组新生鼠脑组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平比较（x±s） |
3 讨论
FGR患儿的围生期病死率较同期正常围生儿高4~6倍，且出生后常易发生新生儿窒息、低氧血症、胎粪吸入综合征、红细胞增多症、酸中毒、低血糖等。此外，FGR最终会导致宫内生长受限患儿头部发育异常，最终导致神经发育异常[10-12]。本结果显示对照组新生鼠FGR发生率为0；FGR组新生鼠FGR发生率为88%，提示建模成功。且补充牛磺酸后，FGR发生率为48%，表明牛磺酸能够减少FGR的发生。同时，FGR组的脑重低于对照组，予以补充牛磺酸后，脑重明显增加；说明FGR的发生导致了新生鼠脑重的降低，产前补充牛磺酸能增加新生鼠脑重。同时FGR组脑重体重比高于对照组，补充牛磺酸后，脑重体重比高于对照组及FGR组，表明牛磺酸主要作用于FGR大脑，增加新生鼠脑重。目前，产前超声可以对胎儿体重、头围、头重以及头重体重比进行估算，宫内生长受限患儿的头部大小是产前预测宫内神经发育不良的独立参数。头重每降低一个标准差，其神经发育不良结局增加10%，提示头重与神经的发育密切相关[12-13]。头重的降低可能介导了生长受限患儿胎盘功能障碍的发生，进一步导致体重下降[13]。本研究提示牛磺酸可降低新生鼠FGR的发生率，且主要表现为增加新生鼠脑重，从而降低其神经发育不良结局。
FABP7阳性的细胞被认为是神经干细胞。FABP7在哺乳动物的神经上皮细胞、脑室下区的放射状胶质细胞特异性表达，放射性胶质细胞在神经发生中具有导向作用，在大脑发育过程中扮演神经干细胞以及神经祖细胞的作用。FABP7在神经干细胞中高表达，且当神经干细胞分化后，其表达水平下降[14]。本研究的RT-PCR、免疫组化及Western blot结果显示FGR新生鼠大脑中FABP7表达降低，予以补充牛磺酸后，FABP7表达明显增加。FGR的发生导致FGR新生鼠大脑神经干细胞的减少，孕鼠产前补充牛磺酸，能促进FGR新生鼠神经干细胞的增殖。
牛磺酸是大脑中含量最丰富的氨基酸之一，大量研究表明牛磺酸能够促进脑的发育及脑保护作用，同时，牛磺酸还可作为一种营养因素以及保护因素，促进大脑神经干细胞的增殖，例如牛磺酸可通过调节多种信号通路的活性因子促进神经干细胞增殖，如WNT信号通路及Shh信号通路的相关因子Gli1、Wnt2、Shh、Cox5a、Ndufv1等[15]。本研究表明，牛磺酸还可以通过调节Rho家族因子RhoA、ROCK2、rac的表达，从而促进宫内生长受限新生鼠神经干细胞的增殖。
目前，Rho家族因子中最主要的因子为Rho、rac、cdc42。Rho家族因子能够参与多种细胞功能，包括细胞骨架、膜运输、细胞周期、基因转录、粘附、迁移和凋亡等[16]。Rho有三种不同的亚型（RhoA、RhoB、RhoC），其中RhoA在神经系统中最有代表性。本研究结果显示FGR新生鼠RhoA表达增加，补充牛磺酸后脑组织中RhoA表达降低。RhoA在神经系统的发育过程中作用于特定的细胞，抑制RhoA的活动, 能够减少新生鼠产后早期发育中神经干细胞的凋亡，从而促使躯体感觉皮质神经元的密度和数量增加[17]；敲除中脑中的RhoA能够促进神经干细胞的生存以及增殖[18]。
ROCK为Rho的下游因子，Rho/ROCK途径是中枢神经系统中普遍存在的介导抑制性信号，阻断中枢神经细胞再生的重要通路[19]。Koyanagi等[20]指出神经干细胞从胚胎干细胞分离后，通过激活Rho/ROCK导致神经干细胞的凋亡。ROCK有两种亚型，ROCK1和ROCK2。其中，ROCK2主要在大脑及脊髓中表达，ROCK2在Rho/ROCK通路中扮演着重要的作用，参与细胞凋亡信号通路以及细胞生存和细胞自噬。ROCK2可以激活磷酸酶、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）以及Fas基因从而降低细胞生存率[20]。ROCK2表达下调能够降低神经细胞的蛋白酶和caspase-3活性，增加苏氨酸蛋白激酶和坍塌反应调节蛋白2水平，从而抑制细胞凋亡及自噬，促进神经干细胞生存。ROCK抑制剂，如法舒地尔和y-2763215，主要通过Rho/ROCK通路影响ROCK2的下游信号，如LIMK1、Akt，从而促进神经干细胞再生以及神经干细胞保护作用，同时，ROCK抑制剂能够在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine, MTPT）损伤、以及氧葡萄糖剥夺、切断或血清剥夺的情况下，发挥神经保护作用[21]。
通常，rac及其下游效应器的激活促进神经干细胞的生存, 而Rho及其下游效应器的激活可诱导神经细胞凋亡。Rho家族的GTP酶（Rho family of GTPases, rac GTPase）生存信号和Rho/ROCK凋亡信号在许多类型的神经细胞如神经干细胞、小脑颗粒神经元和脊髓运动神经元中扮演着重要的角色，以相互拮抗的方式形成一个关键的信号网络, 维持体内神经细胞的生存。本结果显示FGR新生鼠rac表达下降，予以补充牛磺酸后，rac表达增加。其中，Rac GTPase可以短暂快速脉冲刺激导致蛋白激酶21信号下游效应器蛋白激酶A、磷脂酰肌醇3-激酶/苏氨酸蛋白激酶通路以及多种促凋亡Bcl-2家族蛋白如Bad和Bax抑制，促进神经干细胞存活[22]。rac依赖途径能够抑制线粒体凋亡，同时通过Rho的下游效应器如ROCK、PTEN等拮抗Rho，而Rho/ROCK/PTEN可终止Akt激活[23]，提示rac也可通过抑制Rho/ROCK信号通路而促进神经干细胞的增殖。
孕鼠产前补充牛磺酸后能够减少FGR的发生率，牛磺酸主要作用于新生鼠大脑，增加新生鼠脑重；FGR的发生导致新生鼠大脑神经干细胞明显减少，孕鼠产前补充牛磺酸后，能促进新生鼠大脑神经干细胞的增殖，牛磺酸可促进神经干细胞增殖，其机制可能与调控Rho家族因子的活性有关，如抑制Rho/ROCK通路因子RhoA、ROCK2及其下游效应器，激活rac及其下游效应器；是否直接调控Rho家族因子有待于进一步研究。
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