2016, Vol. 18
呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是导致婴幼儿急性下呼吸道感染最重要的病原体，多见于1岁以内的婴儿。RSV感染主要表现为喘息、咳嗽、发热和呼吸困难，重症病例还可造成多系统损伤。临床和实验研究发现，除呼吸道感染外，RSV尚可导致哮喘[1]、急性中耳炎[2]、神经系统受累[3]、心脏损害[4]、肝损害[5]、窒息或死亡[6]等，而肠道损伤鲜有报道。
肺部感染可能导致肠道损伤[7]。多种呼吸道病毒侵害机体后，均可导致肠道组织发生病理改变。Punyadarsaniya等[8]运用精密肠切片技术研究禽流感病毒侵袭鸡的肠道上皮细胞，发现其上皮绒毛也受到明显感染；Wang等[9]发现流感病毒引起肠道损伤，并非由于直接肠道病毒感染，而是与肠道菌群失调及Th17细胞显著增高有关；Matsumoto等[10]报道巨细胞病毒和EB病毒可能加重结肠炎患者肠黏膜的损伤。RSV肺炎患儿常伴随有大便性状和/或次数改变，但是否会导致肠道黏膜组织发生病理改变尚不得而知，亦未见相关报道。
代谢组学（metabonomics）作为系统生物学的重要组成部分，是生物体对病理生理刺激或者基因修饰产生的代谢物的质和量的动态变化研究。气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术灵敏度较高，有较强的分离能力，操作简便，且具备较完善的质谱数据库，已成为代谢组学研究的重要工具。RSV感染小鼠后，机体内环境发生变化，肠道黏膜组织内的代谢物也可能随之发生改变。因此，本研究运用GC/MS代谢组学技术和多维统计分析技术，研究RSV感染后小鼠大肠黏膜组织的内源性代谢物的相对含量变化，以初步探究RSV感染是否损伤大肠黏膜组织及其可能的相关机制。
1 材料与方法 1.1 病毒与细胞RSV A亚型（Long株）由武汉国家典型培养物保藏中心提供，然后进行体外培养人喉癌上皮细胞（human laryngeal epithelial cells, HEP-2）（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）以扩增RSV，具体方法参照文献[11]。病毒滴度则采用Reed-Muench公式测定，本次实验病毒的半数组织细胞感染量（TCID50）为10-4.038/100 μL。
1.2 主要试剂与仪器甲醇（批号1774807513）购自德国Merck公司，正己烷（批号SZBE1070V）、甲氧铵盐（批号BCBN2932V）、吡啶（批号STBD3575V）、含1%三甲基一氯硅烷（TMCS）的N, O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA，批号BCBN4326V）、C8-C40烷烃混标（批号1408653V）、1, 2-13C肉蔻酸（批号SH2326V，内标准品）均购自德国SIGMA-ALORCH公司，标准品如L-谷氨酸（批号LT90M31，纯度99%）、甘氨酸（批号L410N21，纯度98%）、L-天冬氨酸（批号LCA0M32，纯度98%）等均购自中国J & K百灵威公司。DMIL型倒置显微镜（德国Leica公司），MCO-20型CO2培养箱（日本Sanyo公司），Airstream®A2型二级生物安全柜（新加坡ESCO公司），Allegra64R高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司），MiniSpin面包式离心机（德国Eppendorf公司），Savant SPD1010真空离心浓缩仪、Trace1310/TSQ8000 GC-MS仪、TG-5MS毛细管色谱柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）均购自美国Thermo公司。
1.3 实验动物分组、模型建立及样本采集SPF级雌性4~6周龄BALB/c小鼠32只，体重16~18 g，购自北京维通利华动物实验有限责任公司，使用许可证号：SCXK（苏）2012-0004。将小鼠常规饲养于南京中医药大学实验动物中心，置于12 h光照、12 h黑暗环境下自由饮食。实验期间饲养室相对湿度为50%~60%，相对温度设定为18~22℃。将小鼠随机分为对照组、RSV肺炎模型组，每组16只。参照文献[12]，RSV肺炎模型组小鼠在乙醚浅麻醉后，鼻腔滴注100×TCID50的RSV悬液（50 μL/只），每日滴鼻1次；对照组给予同剂量的DMEM高糖培养基滴鼻，待全部吸入鼻腔后放回笼中并记录时间。连续滴鼻3 d，于第6天禁食24 h后（即第7天）处死各组小鼠，剪取大肠，用生理盐水反复冲洗3遍以除去粪便，吸干水分后称重，置于-80℃保存，待测。同时取右肺下叶和部分大肠黏膜组织用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，采用常规的苏木精-伊红（HE）染色，置于光学显微镜下观察。
1.4 GC-MS分析条件气相色谱条件：采用石英毛细管色谱柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m），程序升温条件设定为初始柱温60℃，保留1 min后，以20℃/min逐渐升温至320℃，保留4 min。进样口温度为250℃，载气为高纯氦气，流量为1.2 L/min，柱前压为100 kPa，进样量为1 μL，采用分流模式进样（分流比为20 : 1）。
质谱条件：采用EI源进行电离，碰撞能量为70 eV，离子源温度为280℃，离子传输线温度为250℃，溶剂延迟时间设定为4 min，扫描方式：全扫描，60~600 m/z。
1.5 样品预处理与衍生化将小鼠的大肠组织置于冰上，每个样本准确称量20 mg，置于相应编号的冻存管内，加入1 mL甲醇，然后用球磨仪研磨15 min，吸取600 μL大肠组织匀浆液，加入含10 μg内标1, 2-13C肉蔻酸的甲醇20 μL，涡旋2 min，4℃、10 000转/min离心10 min，取300 μL上清液，置于离心浓缩仪中挥干2 h。加入15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混匀5 min，室温下静置16 h后再加入50 μL的BSTFA（含1%TMCS为催化剂），混匀后静置1 h。4℃、3 000转/min离心分离后，吸取上清液60 μL于玻璃内插管中，供GC-MS进样分析。根据GC-MS所获取的总离子流图（TIC）中各峰的保留时间以分离共有峰，获取相对峰面积比值（各峰面积/内标峰面积）表示代谢物的含量。利用美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱数据库及标准品比对以鉴定共有的内源性代谢物。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。共有峰的挑选、分离、峰对齐、计算相对峰面积使用Xcalibur2.0.7数据处理系统。使用SMCA-P12.0软件（Umetrics公司，瑞典）对大肠组织中内源性代谢物进行主成分分析（principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）和S-plot分析。将筛选出的大肠组织中的差异性代谢物导入代谢通路平台Metaboanalyst，以进一步分析相关代谢通路。
2 结果 2.1 肺组织病理学观察对照组小鼠肺泡上皮完整，结构清晰，肺泡壁毛细血管无扩张充血，肺间隔及支气管结构完好。与对照组相比，RSV肺炎模型组小鼠肺组织病变主要在间质部位，可见多灶性炎性细胞浸润（2+），多为淋巴细胞及单核细胞，并有少量中性粒细胞；肺内支气管上皮细胞排列轻度紊乱，有轻度变性；肺泡壁轻度或中度充血、水肿，以致肺泡壁增厚。见图 1。
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图 1 肺组织病理学观察（HE染色，×200） 对照组肺泡壁结构完整，毛细血管无扩张充血；RSV肺炎模型组间质部位可见多灶性炎性细胞浸润。 |
2.2 大肠组织病理学观察
本研究随机选取对照组和RSV肺炎模型组各5份大肠组织样本进行组织病理学观察，对照组5份样本均未见明显异常; 而其中2份RSV肺炎模型组样本的结肠黏膜层上皮可见轻度（+）变性坏死脱落，余3份样本则均未见明显异常，见图 2。
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图 2 大肠组织病理学观察（HE染色，×200） 对照组大肠组织细胞结构完整清晰；RSV肺炎模型组结肠黏膜层上皮细胞可见轻度（+）变性坏死脱落。 |
2.3 GC-MS分析及代谢物鉴定
GC-MS分析大肠组织TIC结果显示（图 3），对照组和RSV肺炎模型组之间的TIC有较明显的差异，其中保留时间为10.23 min的色谱峰在两组间的差异最显著。峰挑选后发现大肠组织中具有32个共有峰。利用NIST质谱数据库鉴定共有的内源性代谢物，通常匹配度高于800且可能性高于80%的鉴定结果可信度比较高[13]，鉴定结果中某些离子峰的匹配度很高而可能性较低，主要与裂解规律相似及同分异构现象有关。此外，本实验还通过标准品比对以鉴定某些代谢物，共鉴定出32种内源性代谢物（表 1）。为了检测仪器及方法的稳定性和可靠性，对同一组织样品连续进样6次，计算各相对峰面积的相对标准差（RSD）发现，其共有峰的RSD为2.46%~3.78%，提示本研究具有良好的重复性。
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图 3 大肠组织匀浆的TIC图 上图为对照组；下图为RSV肺炎模型组。与对照组相比，RSV肺炎模型组的TIC图显著不同，其中保留时间为10.23 min的色谱峰在两组间的差异最显著。 |
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表 1 大肠组织内所鉴定的代谢物 |
2.4 PCA分析结果
如图 4所示，图中每一个点代表一个样本，模型参数R2X=0.876，Q2=0.697，由主成分1和主成分2构建的得分散点图显示对照组和RSV肺炎模型组具有明显的分离趋势。
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图
大肠组织的PCA分析（n=11）
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2.5 OPLS-DA分析
如图 5所示，图中每一个点代表一个样本，模型参数R2X=0.867，R2Y=0.934，Q2=0.889，说明该模型的建模能力和预测能力均较好，对照组、RSV肺炎模型组可显著区分，无交叉和重叠，提示RSV肺炎干扰了小鼠大肠组织中某些内源性物质的代谢，造成小鼠大肠组织的代谢指纹图谱发生显著变化。与对照组相比，RSV肺炎可能导致大肠黏膜组织受到损伤。
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图 5
大肠组织的OPLS-DA分析（n=11）
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2.6 S-plot分析
在可视化的OPLS-DA图下，设定变量权重值VIP > 1的代谢物为大肠组织中潜在与RSV肺炎损伤相关的代谢物。为进一步筛选，本研究分析了基于OPLS-DA的S-plot图，如图 6示，乳酸、丙氨酸、尿素、磷酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、花生四烯酸等代谢物可能与大肠组织的代谢指纹图谱变化有关。
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图 6
大肠组织的S-plot分析（n=11）
S-plot显示代谢物的分布情况。 |
2.7 代谢物含量的差异表达
与对照组相比，RSV肺炎模型组大肠组织代谢物中亮氨酸（P=0.006）、异亮氨酸（P=0.013）、丙氨酸（P=0.001）、甘氨酸（P=0.01）、花生四烯酸（P=0.001）和乳酸（P=0.008）的含量均升高，见表 2。
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表 2 大肠组织中代谢物相对含量比较（x±s） |
2.8 代谢通路分析
将上述大肠组织中的差异性代谢物导入代谢通路平台Metaboanalyst分析，代谢通路的重要值（pathway impact, PI）界定为0.1，结果见图 7。由此可知，与大肠损伤最为相关的是缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸代谢（PI=0.32601），花生四烯酸代谢（PI=0.14979）和丙酮酸代谢（PI=0.10625）通路。
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图 7 与大肠损伤可能相关的代谢通路 A：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸代谢；B：花生四烯酸代谢；C：丙酮酸代谢。 |
3 讨论
RSV属于肺炎病毒属副粘病毒科，为有包膜的单链负链RNA病毒，是婴幼儿病毒性肺炎的最常见病因。RSV肺炎可能并发多系统损伤，原因可能是肺炎导致的低氧血症和RSV病毒的毒素作用。临床观察发现，RSV肺炎患儿多有大便性状或次数改变，推测可能是RSV肺炎状态下大肠的功能受到影响所致。
作为一类特异性抗原，病毒侵袭人体后，常引起机体代谢物及相关代谢通路的变化。Munger等[14]研究发现在人巨细胞病毒感染时，细胞内糖酵解、三羧酸循环、嘧啶合成的相关代谢物呈动态变化；Semmo等[15]报道丙型肝炎病人血浆内葡萄糖、甘露糖、油酸酰胺和乳酸等代谢物的含量发生显著变化。本研究表明，RSV肺炎可能导致小鼠大肠黏膜组织受损伤，影响大肠细胞的代谢功能。与对照组相比，RSV肺炎的小鼠大肠中亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、花生四烯酸、乳酸等物质的含量均上调，提示大肠细胞内的代谢紊乱，推测RSV肺炎可能干扰大肠中的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通路、花生四烯酸通路与丙酮酸通路。
支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAA）如亮氨酸和异亮氨酸是机体的必需氨基酸，对维持生物体的机能具有重要意义。BCAA主要通过肠道吸收，成人摄入的亮氨酸有20%~30%可被肠黏膜利用[16-17]，婴儿摄入的亮氨酸中，肠道组织利用量可达42%~48%[18]。在肠道细胞内，除用于蛋白质合成外，大部分BCAA通过转氨基和脱羧两条途径进行分解代谢[19]。Chen等[20]研究发现，大量BCAA在猪肠道上皮细胞内通过氨基转移途径进行代谢。与转氨基作用相比，支链氨基酸A-酮酸氧化脱羧作用有限，仅有30%左右的支链A-酮酸发生羧基氧化反应。肠上皮细胞中支链A-酮酸氧化量很低，因此BCAA不是其主要能量物质[21]。
本研究发现RSV肺炎模型组中的支链氨基酸较正常组上升，可能是RSV肺炎状态下机体缺氧，细胞内无氧代谢增强，乳酸含量升高，大肠组织细胞能量供应不足，导致氨基转移酶活性下降，因此亮氨酸、异亮氨酸在细胞内累积。此外，异亮氨酸可以促进β-防御素的表达，提高肠道免疫防御功能，抵御小鼠肠道沙门氏菌感染[22]。因此，异亮氨酸在大肠细胞内浓度增高，可能还与RSV感染后大肠免疫紊乱有关。
花生四烯酸作为机体内的一种必需脂肪酸，其代谢衍生物具有重要的生物活性。花生四烯酸在生物体内主要是以磷脂的形式存在于细胞膜上，在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解成游离的花生四烯酸。虽然游离的花生四烯酸在正常的生理状态下水平很低，但当细胞膜受到各种刺激时，花生四烯酸便从细胞膜的磷脂池中释放出来并转变为具有生物活性的代谢产物。前列腺素可以增加肠液的分泌，白三烯C4与白三烯D4则可以收缩肠道尤其是回肠平滑肌。本研究发现RSV肺炎模型组大肠组织内花生四烯酸含量增高，可能是机体患RSV肺炎时，大肠组织细胞受到刺激，因此可能导致其花生四烯酸含量增高，肠液分泌增加及肠道平滑肌收缩，从而引起大便性状和/或次数的改变。此外，前列腺素E2减少可能与烫伤后大鼠肠黏膜损伤有关[23]，而本研究发现RSV肺炎后花生四烯酸增加，这还可能与机体的防御性反应有关，通过花生四烯酸代偿性增加以减轻大肠黏膜损伤。
甘氨酸在机体内参与蛋白质和多种与代谢相关的生物活性分子的合成，作为天然调节剂，具有显著生物活性。研究发现，甘氨酸能抑制肠黏膜肥大细胞脱颗粒，降低肠黏膜及肠血管通透性，减少肠源性内毒素的吸收[24]；促进肠碱性磷酸酶的表达，减轻肠黏膜屏障损伤，可明显改善肠源性内毒素血症[25]；降低脂多糖和缺氧诱导的大鼠血清TNF-α水平和过量的NO水平，减轻病理损伤[26]。RSV肺炎时，大肠黏膜组织缺氧，能量供应不足，可能会引起大肠病理损伤，而大肠黏膜具有自体修复功能。本研究发现RSV肺炎模型组大肠组织内甘氨酸含量较对照组上升，推测是机体在大肠病理损伤时自体修复，导致甘氨酸可能在大肠组织中蓄积，从而改善大肠血管通透性，减少内毒素吸收，减轻黏膜损伤。
丙氨酸是体内的一种非必需氨基酸，胡森等[27-28]发现丙氨酸可以减少肠黏膜血流量，加重肠黏膜的代谢应激，使肠黏膜吸收能力下降，ATP含量降低，从而加重肠道缺血再灌注损伤。本研究发现，RSV肺炎模型组小鼠的大肠组织中丙氨酸含量较高，可能会导致肠黏膜血流量减少和肠组织吸收能力下降。
本研究通过GC/MS代谢组学和多维统计分析方法研究RSV肺炎小鼠大肠组织代谢物的变化，发现RSV肺炎可能引起大肠黏膜组织损伤，RSV肺炎小鼠大肠组织中亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、花生四烯酸、乳酸等代谢物含量均较对照组增高，可能涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢，花生四烯酸代谢和丙酮酸代谢通路。因此，RSV肺炎导致大肠黏膜损伤可能与RSV产生的毒素及机体缺氧有关。但是，大肠黏膜损伤程度以及具体的损伤机制，仍有待深入探究。
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