哮喘发生过程中最重要的病理特征是气道炎症和气道重塑。随着气道炎症的发展，进一步导致持续性气道高反应和气道管腔狭窄，引起气道重塑的发生，造成气道不可逆气流阻塞，最终导致哮喘慢性化。越来越多的文献报道哮喘小鼠体内Th17细胞及CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Treg）表达失衡与气道炎症和气道重塑的发生相关^[1-3]。半胱氨酰白三烯（CysLTs）作为哮喘发病机制中的重要炎症递质，能够引起呼吸道平滑肌收缩，促进呼吸道结构细胞增殖^[4]，参与哮喘气道重塑的发生。为探讨孟鲁司特钠干预后哮喘气道重塑的动态变化过程对Th17与CD4⁺CD25⁺Treg免疫平衡的影响，为临床更好地预防和控制哮喘提供实验室依据，本课题组进行了该实验，现报道如下。

SPF级Balb/c雌性小鼠72只，4~6周龄，体重14±2 g，由成都达硕生物有限公司提供（质量合格证NO-0016815），饲养于四川省人民医院动物房，SPF级环境，喂养不含过敏原的无菌食物，专用动物饮水。

SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备厂）；CYTOMICSFC500流式细胞仪（美国BACK MAN COULTER公司）；细胞记数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；Apex雾化器（台湾雅博股份有限公司）；离心机（科大创新股份有限公司）；数码三目摄像显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司）；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

孟鲁司特钠咀嚼片4 mg/片（杭州默沙东制药有限公司）；卵清蛋白（OVA）、离子霉素（美国Sigma公司）；兔抗鼠IL-17单克隆抗体（PE标记）、兔抗鼠CD4单克隆抗体（FITC标记）、兔抗鼠CD25单克隆抗体（PE标记）均购自美国Biolegend公司。

将Balb/c小鼠随机分成空白组、哮喘组、孟鲁司特钠组，每组24只。依据沈华浩等^[5]、Temelkovski等^[6]方案加以调整，自制小鼠雾化吸入箱（30 cm×24 cm×20 cm），利用OVA被动致敏并激发的方法建立哮喘小鼠气道重塑模型。哮喘组、孟鲁司特钠组分别在实验开始和实验第14天经腹腔注射0.2 mL致敏混悬液（含20 μg OVA和100 μg氢氧化铝）致敏，空白组经腹腔注射等量生理盐水致敏。第21天起，哮喘组、孟鲁司特钠组给予2.5% OVA混悬液雾化激发，每次约30 min，隔天1次，空白组给予等量生理盐水雾化激发。孟鲁司特钠组在每次雾化前给予0.1 mL白三烯受体拮抗剂孟鲁司特钠混悬液（1 mg/kg）灌胃，孟鲁司特钠药物剂量根据陈奇等^[7]关于药物剂量估换计算公式推算出，空白组和哮喘组以等量生理盐水代替。最长雾化时间8周。

3组小鼠分别在雾化2周、4周及8周后的24 h内随机处死8只小鼠，然后固定在解剖台上，充分暴露肺部组织，取适量事先准备好的10%多聚甲醛经气管注入灌洗肺部组织；取左肺固定在10%的多聚甲醛中72 h以上，再取出依次经清水及浓度梯度乙醇溶液脱水，用氯仿进行透明化处理，电热恒温箱内侵蜡，石蜡包埋，制备成5 μm厚的肺组织样本；并制作成载玻片贴片，再经纯酒精及梯度酒精蒸馏水化，经苏木精染色，观察肺组织形态结构及炎症情况。每个标本随机选取3张切片，每张切片先于光学显微镜放大100倍下观察全部组织病理变化，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域放大200倍采集图像；应用医学图像分析软件Image-Pro Plus 6.0，测定支气管基底周径（Pbm）、总管壁厚度（Wat）、平滑肌厚度（Wam），并用Pbm进行标准化，若每张切片采集多张图像，则取平均值，进行统计学分析。

同时暴露并取下脾脏组织放在准备好的PRMI1640培养液中进行冲洗；将取好的脾组织剪碎置于细胞过滤筛网上研磨、过滤，并加入小鼠淋巴细胞分离液，利用密度梯度离心法分离制备脾组织单个核细胞悬液，上流式细胞仪检测Th17细胞、CD4⁺CD25⁺Treg细胞和CD4⁺T细胞的百分比。

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；采用Pearson直线相关对双变量间进行相关性分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

与空白组相比，哮喘组、孟鲁司特钠组小鼠在实验期间均出现毛发失去光泽、少动、活动进食减少、反应迟钝等表现，在雾化激发过程中出现烦躁、骚鼻、呼吸急促或呼吸困难、点头呼吸、口唇青紫、毛发竖起、腹部肌肉痉挛、二便失禁等急性哮喘发作的症状，其中孟鲁司特钠组上述症状较哮喘组明显减轻。

空白组小鼠的气道黏膜平整、连续，没有皱褶，黏膜下炎症细胞不多，支气管肺组织结构正常，未见杯状细胞的异常增生及黏液分泌，平滑肌层均匀，气道管壁没有增厚。哮喘组小鼠在激发2周后可见支气管壁及血管周围有大量炎性细胞浸润，上皮细胞肿胀，部分变性、坏死、脱落，气道平滑肌层增厚，杯状细胞增生伴黏液高分泌，部分可见黏液栓堵塞，基底膜增厚；随着激发时间的延长，气道平滑肌细胞增生及气道管壁增厚更明显，即8周组气道病理损害重于4周组及2周组，4周组又重于2周组。孟鲁司特钠组小鼠在激发2周、4周、8周后仍可见支气管及血管周围炎性细胞浸润，杯状细胞黏液分泌，上皮细胞脱落不全，基底膜及气道平滑肌增厚等病理变化；且随着激发时间的延长，这些变化有加重趋势；但与模型组比较，小鼠气道的病理损害均有明显减轻。见图 1。

图 1 各组不同时间点肺组织病理切片（苏木精-伊红染色，×100） 空白组未见气道炎症改变；模型组细支气管及血管周围均可见大量炎性细胞浸润；孟鲁司特钠组炎症改变较哮喘组明显减轻。

哮喘组及孟鲁司特钠组激发2周后支气管Wat、Wam开始增厚，与空白组比较差异均有统计学意义（P < 0.05），至8周时哮喘组增厚更明显（P < 0.05）；孟鲁司特钠组支气管Wat、Wam均较同期哮喘组减轻，但仅8周时差异有统计学意义（P < 0.05）；提示用孟鲁司特钠干预哮喘小鼠后能减轻气道重塑的发生，且随着用药时间延长，改善越明显。见表 1。

表 1

表 1 各组小鼠各时间点肺组织气道重塑情况（n=8，x±s，μm2/μm）

表 1 各组小鼠各时间点肺组织气道重塑情况（n=8，x±s，μm2/μm）

各时间点哮喘组、孟鲁司特钠组Th17细胞占CD4⁺T细胞百分比均较空白组升高（P < 0.05）；且孟鲁司特钠组Th17细胞占CD4⁺T细胞百分比均较同期哮喘组减少，但仅8周时差异有统计学意义（P < 0.05）。各时间点哮喘组、孟鲁司特钠组CD4⁺CD25⁺Treg占CD4⁺T细胞百分比均较空白组降低（P < 0.05）；且孟鲁司特钠组CD4⁺CD25⁺Treg占CD4⁺T细胞百分比均较同期哮喘组增加，但仅8周时差异有统计学意义（P < 0.05）。提示用孟鲁司特钠干预哮喘小鼠后可改善Th17细胞、CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表达异常，且随着用药时间延长，改善越明显。见表 2，图 2~3。

表 2

表 2 各组小鼠各时间点脾组织中Th17细胞和CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞百分比比较（n=8，x±s，%）

表 2 各组小鼠各时间点脾组织中Th17细胞和CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞百分比比较（n=8，x±s，%）

图 2 各组小鼠不同时间点脾组织中Th17细胞占CD4+T细胞百分比的流式细胞仪分析图 随着干预时间延长，孟鲁司特钠组Th17细胞百分比均较同期哮喘组减少。右下角方框所示为Th17细胞占CD4+T细胞百分比。图中横轴为IL-17A PE，纵轴为SSlin。

图 3 各组小鼠不同时间点脾组织中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞百分比的流式细胞仪分析图 随着干预时间延长，孟鲁司特钠组CD4+CD25+Treg百分比均较同期哮喘组增加。右下角方框所示为CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞百分比。图中横轴为CD25 PE，纵轴为SSlin。

孟鲁司特钠组小鼠在2周、4周、8周时Th17细胞数与支气管Wat、Wam分别呈正相关（Wat：r=0.911、0.854、0.971，均P < 0.01；Wam：r=0.977、0.936、0.937，均P < 0.01）。CD4⁺CD25⁺Treg细胞与支气管Wat、Wam分别呈负相关（Wat：r=-0.895、-0.876、-0.971，均P < 0.01；Wam：r=-0.975、-0.944、-0.953，均P < 0.01）。

哮喘是一种免疫功能异常导致的变态反应性疾病，涉及多种炎症细胞及其分泌的介质参与其炎症过程。长期的慢性气道炎症导致持续气道高反应性和气道重塑，是引起哮喘患者不可逆性呼吸道阻塞和难治性哮喘的病理基础和重要原因之一。本课题组的前期研究证实，若不进行干预，哮喘小鼠气道重塑的病理变化呈进行性加重^[8]。近年来研究者们发现Th17/CD4⁺CD25⁺Treg细胞的免疫紊乱在哮喘发生发展和疾病过程中起着重要的作用。IL-17作为Th17细胞的主要效应因子，刺激结构细胞高表达IL-6、TGF-β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、基质金属蛋白酶MMP-9等，通过多种方式参与气道重塑^[9]。胸腺源性CD4⁺CD25⁺Treg细胞具有免疫抑制和免疫无能性，可通过分泌IL-10和TGF-β，转录Foxp3+细胞因子发挥特异性调控作用。本实验发现在哮喘小鼠Th17细胞数增加的同时气道Wat和Wam亦增加，且呈正相关；而CD4⁺CD25⁺Treg细胞数逐渐下降，且与气道Wat和Wam呈负相关。提示哮喘小鼠中确实存在CD4⁺CD25⁺Treg细胞数减少同时Th17细胞数目增加的免疫失衡。因此及时有效的治疗是避免和减轻气道重塑的关健。

白三烯是参与哮喘发病非常重要的炎症介质之一，尤其是CysLTs，具有强大的促气道上皮细胞增殖的作用，Wilson等^[10]的研究提示LTC4能强烈诱导人肺成纤维细胞表达，产生TGF-β、IL-4和IL-13等，引起平滑肌增生肥大，高水平的TGF-β进一步导致网状基底膜增厚^[11]。由此可见CysLTs可通过多种途径介导炎症反应致使气道管壁的增厚。吸入糖皮质激素（ICS）作为哮喘治疗的一线药在气道重塑治疗中的作用存在诸多争议，目前大部分文献报道认为它对气道重塑的防治作用甚微，可能与ICS不能覆盖各级支气管有关^[12]。也有研究认为激素类药物不能抑制哮喘患者体内与气道重塑的发生密切相关的炎性介质白三烯的产生及释放。所以CysLTs受体拮抗剂孟鲁司特钠作为新型非激素类抗炎药能阻断CysLTs与受体结合，抑制白三烯的生物学活性，弥补糖皮质激素治疗的不足，在抑制气道重塑中发挥一定的作用。2015年修订的GINA再次指出白三烯调节剂可作为除吸入性糖皮质激素外，唯一可以单独应用的长期控制药物^[13]。目前许多临床研究证实CysLTs受体拮抗剂孟鲁司特钠能够改善哮喘患者的临床症状，抑制气道重塑，发挥有效的临床作用^[14]。

近年来诸多研究均显示CysLTs受体拮抗剂孟鲁司特钠应用后可抑制气道的炎症反应及黏液的分泌，阻止气道结构细胞增生，上皮下胶原的沉积以及上皮下纤维化，能够有效抑制气道重构。如Shin等^[15]、Souza等^[16]及Yamakawa等^[17]研究结果均显示CysLTs受体拮抗剂使IL-4的浓度下降，既可减少TGF-β的生成，抑制CysLTs受体1 mRNA及其蛋白的表达，还可抑制嗜酸性粒细胞趋化因子-3的表达，减少嗜酸性粒细胞的合成及IgE生成，抑制免疫反应，同时减少初始CD4⁺T细胞向Th17细胞的分化，从而减少炎症因子IL-17的产生，达到控制炎症反应，抑制气道重塑的目的。另外有研究认为孟鲁司特钠能通过提高IFN-γ表达，反馈性抑制IL-17的生成，抑制气道重塑的发生^[18]。国内也有相应研究的报道，如王涛等^[19]的动物实验研究提示用孟鲁司特钠干预哮喘大鼠后，其哮喘的症状有所改善，气道病理学检测支气管周围炎性细胞侵润，气道杯状细胞占上皮细胞百分比，胶原沉积和平滑肌增生面积均低于模型组。杨洋等^[20]用流式细胞技术检测使用孟鲁司特钠干预哮喘大鼠后，肺组织中Th17细胞数降低，CD4⁺CD25⁺Treg细胞表达水平增加，并借此进一步减轻呼吸道炎症，抑制气道重塑。另有研究提示，孟鲁司特钠可通过增加肺组织IL-10的水平来调控CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表达^[21]。本实验在此基础上进行了长达8周的动态变化观察，研究结果进一步证实了用孟鲁司特钠干预哮喘小鼠后肺组织气道重塑程度减轻、CD4⁺CD25⁺Treg表达增加、Th17细胞的表达降低，且随着用药时间延长，改善越明显。说明长期运用白三烯受体拮抗剂后能延缓哮喘气道重塑的发生，减轻已发生的气道重塑的严重程度，但并不能使这种病理变化完全逆转，这与周卫芳等^[22]的研究结果一致。

总之，实验进一步证实，Th17/CD4⁺CD25⁺Treg的表达异常、免疫平衡被打乱是哮喘发病的重要原因之一，也与气道重塑的发生和发展密切相关；而给予孟鲁司特钠干预后这一免疫失衡得到改善，气道重塑的病理变化得到抑制和减轻，且随着用药时间延长，改善越明显。鉴于孟鲁司特钠具有口服方便、安全，不良作用少的优点，系非激素类药物，易于患儿和家长接受。有望在哮喘的预防和治疗儿童哮喘特别是在防止哮喘患儿气道不可逆性的损害中发挥更重要的作用。