急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）为髓系前体细胞恶性克隆增殖性肿瘤，在临床表现、细胞遗传学、分子遗传学、治疗反应和预后方面均呈现高度异质性。目前国内外公认细胞遗传学和分子生物学异常为AML分型诊断和分层治疗的重要依据，但相当部分儿童AML并无特异性的细胞或分子遗传学标志。因此，如何对儿童AML进行更精细的危险度分组以指导个体化治疗对于进一步提高AML预后具有重要临床意义。

肾母细胞瘤基因1（Wilms tumor gene 1, WT1）定位于染色体11p13，最早从Wilms瘤细胞中被克隆，与Wilms瘤发生、发展密切相关^[1-2]。国内外研究表明，WT1高表达为很大一部分AML患者的常见分子生物学异常^[3-5]。WT1作为一种泛白血病基因，其表达水平在指导AML治疗、预测复发和预后评估方面的临床应用价值已在国外得到高度重视^[6-8]，但国内关于AML患儿WT1表达及临床意义方面的研究较少。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测儿童AML的WT1表达水平，研究其变化规律，探讨与AML患儿化疗反应和预后的关系。

收集2009年4月至2016年1月于四川大学华西第二医院确诊的45例儿童AML病例，不包括急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）。本组AML病例均于我院儿童血液肿瘤科接受正规化疗，并有完整的随访资料。本研究获得医院伦理委员会批准及监护人书面知情同意。

淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。Trizol试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。Takara逆转录试剂盒购自日本Takara生物有限公司。荧光定量PCR体系购自北京优尼康生物科技有限公司。WT1基因引物及探针由上海Invitrogen公司设计及合成。

采集45例AML患儿不同时间点骨髓标本并检测WT1表达水平，共180例次。AML病例组各亚型骨髓标本采集时间点和例次数见表 1。9例复发患儿中的1例为随访截止点确诊复发，5例复发患儿放弃治疗后死亡，3例复发后姑息化疗、带瘤生存（期间未规律进行WT1检测）。

表 1

表 1 AML患儿各亚型骨髓采集时间点和例次数

表 1 AML患儿各亚型骨髓采集时间点和例次数

采集EDTA抗凝骨髓标本1~2 mL。淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。采用Trizol试剂提取细胞总RNA后逆转录制备cDNA。WT1目标基因和ABL1内参基因引物及探针序列见表 2。WT1和ABL1基因扩增产物长度分别为120 bp和129 bp。荧光定量PCR反应体系：Taqman Fast Master Mix（5×）4 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，荧光探针1 μL，cDNA模板5 μL，灭菌去离子水9 μL。反应条件：95℃变性10 min，然后进行45个PCR循环（95℃变性10 s，60℃退火60 s）。根据WT1和ABL1各自荧光定量PCR反应的Ct值，对照各自相应的标准曲线，计算其拷贝数，WT1相对表达量=（WT1拷贝数/ABL1拷贝数）×10⁴。诱导化疗结束时WT1表达水平的下降程度以log（初诊时WT1相对表达量/诱导化疗结束时WT1相对表达量）表示^[9-10]。

表 2

表 2 WT1及ABL1的引物及探针序列

表 2 WT1及ABL1的引物及探针序列

AML治疗参照英国医学研究委员会AML15诊疗方案^[11]。疗效评估^[12]：骨髓原始和幼稚细胞 < 5%定义为完全缓解（complete remission, CR）；原始和幼稚细胞≥5%，但 < 25%定义为部分缓解；原始和幼稚细胞≥25%定义为未缓解；CR后骨髓原始和幼稚细胞≥25%定义为复发（本研究未纳入孤立性髓外复发病例）。

随访截止至2016年2月1日，中位随访时间20个月（1~82个月）。总生存期为确诊之日至随访终点或任何原因所致死亡的时间。无病生存期为CR之日至复发或任何原因死亡的时间。

采用SPSS 22.0统计学软件进行相关统计学处理。非正态分布计量资料采用中位数（范围）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis方法，两组比较采用Mann-Whitney检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析进行，Log-rank检验分析AML各阶段WT1表达水平与生存率的关系。P < 0.05为差异具有统计学意义。

19例患儿初诊时WT1的中位表达量为1 525（50~29 407）。AML初诊时WT1相对表达量与性别、年龄、外周血白细胞总数、染色体核型及诱导化疗后的缓解状况均无明确相关性；如以AML患儿初诊时骨髓幼稚细胞比例的中位值60%作为截断值，骨髓幼稚细胞比例 > 60%者WT1表达水平较高（P=0.017）；M2病例组初诊时WT1中位表达量低于非M2病例组（P=0.043）。见表 3。

表 3

表 3 AML初诊时WT1表达水平与临床特征及诱导缓解状况的关系[中位数（范围）]

表 3 AML初诊时WT1表达水平与临床特征及诱导缓解状况的关系[中位数（范围）]

初诊及复发的WT1表达量均高于缓解期（P < 0.01）；WT1中位表达量在初诊与复发时的差异无统计学意义（P=0.772）。见表 4。

表 4

表 4 AML不同疾病状态下WT1表达水平的比较[中位数（范围）]

表 4 AML不同疾病状态下WT1表达水平的比较[中位数（范围）]

本研究对22例AML患儿的WT1表达水平进行动态检测（13例自初诊时开始，9例从诱导化疗结束后开始），其中3例AML骨髓复发。复发病例在持续缓解期WT1表达量维持在相对稳定的低水平，但骨髓复发2~3个月前WT1表达量即呈上升趋势，其中2例复发时WT1表达量（分别为161和3 650）升高至初诊水平（191和2 542）。另1例AML患儿两次骨髓复发，第2次复发时WT1相对表达量（2 160）较首次复发时（788）升高2.7倍，见图 1。

图 1 1例两次复发的AML患儿WT1表达水平变化

以AML患儿初诊时WT1中位表达量（1 525）为截断值，将AML患儿分为高、低表达组，高表达组和低表达组的2年总生存率（overall survival，OS）及无病生存率（disease-free survival, DFS）分别为64%和60%，89%和84%，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 5。

表 5

表 5 AML患儿初诊时WT1高、低表达组的2年OS和DFS比较（%）

表 5 AML患儿初诊时WT1高、低表达组的2年OS和DFS比较（%）

18例AML患儿在初诊和诱导化疗结束时均进行了WT1表达水平的检测。诱导化疗结束时WT1表达下降程度的中位值为1个数量级，下降程度≥1个数量级患儿的2年OS和DFS均高于下降程度 < 1个数量级患儿，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表 6、图 2。

表 6

表 6 诱导化疗结束时WT1表达水平下降程度与生存情况的关系（%）

表 6 诱导化疗结束时WT1表达水平下降程度与生存情况的关系（%）

图 2 诱导化疗结束时不同WT1下降程度的AML患儿生存曲线

以诱导化疗结束的WT1中位表达量（49）为截断值分为高、低表达组。高表达组的2年DFS（58%）低于低表达组（86%）（χ²=5.263，P=0.022），见图 3；其2年OS与低表达组的差异（67% vs 86%）无统计学意义（χ²=2.597，P=0.107）。以巩固化疗结束时WT1中位表达量（53）为截断值分为高、低表达组，WT1高表达和低表达组的2年OS（73%，92%）及DFS（64%，83%）差异均无统计学意义（P > 0.05）。

图 3 AML患儿诱导化疗结束时WT1高、低表达组的无病生存曲线

WT1在不同AML亚型，以及相同AML亚型不同个体之间的表达情况均存在较大差异。国内外相关研究表明，WT1表达水平以AML-M3最高，其它亚型AML的WT1表达量各家报道不一^[13-14]；而AML1-ETO融合基因阳性M2病例的WT1表达水平明显低于其它AML亚型^[15]。本研究未纳入AML-M3，但结果也表明，AML-M2病例组WT1表达水平最低；而且初诊时WT1的表达水平与骨髓幼稚细胞百分比具有明确相关性，与性别、年龄、外周血白细胞总数、染色体核型及第1疗程诱导是否缓解无关。

此外，本研究发现初诊及复发AML病例组WT1的表达水平高于完全缓解期病例组。动态监测22例AML患儿WT1表达水平，发现骨髓复发2~3个月前WT1表达量即呈上升趋势。我们推测，WT1表达水平与白血病肿瘤细胞负荷程度有关，因此，了解WT1基因表达水平的动态变化有助于AML的疗效评估和复发预测。

多数研究表明，初诊时WT1高表达为成人AML独立的不良预后因素^[16-17]，但对于初诊时WT1表达水平与儿童AML预后的关系仍无统一意见。Rodrigues等^[18]对41名初诊时完成WT1表达水平检测的AML患儿进行随访，结果显示WT1高表达的AML患儿总生存率更高。而Noronha等^[19]对155名AML患儿的研究显示，初诊时WT1表达量与长期生存率无明确相关性。本研究结果也表明初诊时WT1表达水平与预后无关。因此，需要扩大样本量进行长期随访研究以进一步明确初诊时WT1表达水平与儿童AML长期预后的关系。

微小残留病（minimal residual disease, MRD）水平检测在指导儿童白血病个体化治疗、预后评估和复发预测方面具有重要临床价值。对于初诊时具有特定非随机性细胞遗传学异常和/或分子生物学异常的AML病例，临床上通过动态监测这些异常是否恢复进行预后评估和复发预测。但对于很大一部分没有特定细胞遗传学和/或分子生物学异常的AML病例，WT1作为一种泛白血病标记基因即具有重要的临床应用价值。Shibasaki等^[9]对48名成人AML的研究显示，诱导化疗和巩固化疗结束时WT1表达量的降低程度如较初诊时大于2个数量级，则预后良好。本研究同样显示，诱导化疗结束时WT1表达量下降程度 < 1个数量级的病例其2年OS和DFS均显著低于下降程度≥1个数量级病例。Nomdedéu等^[20]分析了584名成人AML患者各时间点WT1表达水平与预后的关系，发现诱导及巩固化疗结束时WT1持续高表达者预后不良。本研究未发现AML患儿巩固化疗结束时WT1表达水平与预后具有明确相关性。结合国外学者的研究结果，我们认为，诱导化疗阶段有效杀灭白血病细胞的程度是诱导化疗结束时WT1下降程度的决定性因素，诱导化疗结束时WT1表达水平可一定程度上反映AML白血病细胞对化疗的敏感性。因此，诱导化疗结束为检测WT1表达水平的一个重要时间节点。

综上，WT1表达与儿童AML预后密切相关，但能否将WT1作为AML分型诊断和分层治疗的依据需进一步研究，但我们相信通过不断深入的研究，最终能够阐明WT1在AML中的作用机制，为临床治疗提供更多的依据。