2016, Vol. 18
, 李粹, 徐玮玮, 牛峰海, 张娣 枫糖尿病（maple syrup urine disease, MSUD）为氨基酸代谢病的一种，又称支链酮酸尿症，是由于催化亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的支链α-酮酸脱氢酶（branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase，BCKDH）复合体功能缺陷，使得支链氨基酸（branched chain amino acids，BCAA）转氨形成的相应支链α-酮酸（branched chain alpha-ketoaeid, BCKA）不能进行氧化脱羧，导致体内的BCAA和BCKA异常增高。BCAA如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸大量蓄积对脑组织产生神经毒性作用，导致脑白质病变；而BCKA可从尿及体液中排出，因而出现类似枫糖浆的气味。MSUD于1954年由Menkes等[1]最早报道，国外统计其发病率为1/12万~1/50万不等[2]，国内相关报道不多[3]，特别是双胎同时发病者未见报道。本研究对枫糖尿病双胎新生儿的临床资料进行分析，并对患儿及其父母进行相关基因测序分析，寻找发病的分子遗传学证据。
1 资料与方法 1.1 研究对象病例1：患儿，女，汉族，8 d，双胎之大，因腹胀、拒乳1 d入院。患儿为第3胎第2产，胎龄37+4周，剖宫产出生，出生体重2 800 g，出生无窒息史，脐带、羊水、胎盘无异常。生后2 h开始配方奶喂养。
父母亲均24岁，农民，非近亲婚配，身体健康。
体格检查：T 36.5℃，P 128次/min，R 38次/min，体重2 740 g。足月新生儿貌，刺激反应差。颜面部、躯干部皮肤轻微黄染，前囟平软。心肺听诊无异常。腹膨隆，肝肋下2.0 cm、剑突下2.0 cm，质软，肠鸣音4次/min，四肢肌张力高，吸吮反射、觅食反射、拥抱反射减弱。
辅助检查：血常规WBC 24.5×109/L（正常值：10~15×109/L）、淋巴细胞比率35.5%、中性粒细胞比率58.9%，HGB 180 g/L（正常值：145~220 g/L）、PLT 326×109/L（正常值：125~350×109/L）。尿常规：酮体2+、pH 6.0。粪常规正常。肝肾功能、心肌酶、血糖及电解质均正常，血气分析提示代偿性代谢性酸中毒。脑脊液检查正常。血酮体5.20 mg/dL（正常值：0~3.12 mg/dL）。X片提示肺炎，肠腔积气、扩张。头部MRI：双侧小脑半球齿状核、脑干、基底节区及双侧放射冠至皮质区对称性异常信号：代谢性脑病可能性大（图 1A~C）。入院第2天采血行串联质谱检测，显示亮氨酸为3 471μmol/L（正常值： < 375 μmol/L）、缬氨酸561μmol/L（正常值： < 325 μmol/L）。
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图 1 双胎患儿头部MRI 图 1A~C：双胎之大第9天头部MRI。双侧小脑半球齿状核（图 1A）、基底节区（图 1B）、双侧放射冠至皮层区（图 1C）对称性片状等T1、略长T2异常信号（箭头所示），边缘模糊。图 1D~F：双胎之小第10天头部MRI。基底节丘脑（图 1D）、双小脑半球（图 1E）、放射冠（图 1F）对称性片状长T1低信号、长T2高信号（箭头所示）。 |
治疗经过：入院后予配方奶喂养、控制感染，第2天出现反复抽搐，呼吸浅慢，尿液有枫糖浆气味，予苯巴比妥钠镇静，甘露醇降颅压，神经节苷脂营养脑细胞等治疗；结合血串联质谱检测结果，入院第3天临床诊断为枫糖尿病，予去除BCAA的特殊配方奶粉喂养及维生素B1口服，病情无改善；入院第5天患儿家长要求放弃治疗，出院后死亡。
病例2：患儿，男，8 d，因拒乳、发热5 h入院。患儿为第3胎第2产，胎龄37+4周剖宫产出生，系双胎之小，出生体重2 130 g，生后无窒息史，脐带、羊水、胎盘无异常。患儿生后2 h开始配方奶喂养，入院前5h出现拒乳、嗜睡、发热。体格检查：T 37.4℃，P 130次/min，R 42次/min，体重2 300 g。足月新生儿貌，刺激反应差，颜面部、躯干部皮肤轻微黄染，前囟平软。心肺听诊无异常。腹略膨隆，肝肋下1.5 cm、质软，肠鸣音5次/min。肌张力可，吸吮反射、觅食反射、拥抱反射减弱。
辅助检查：血常规正常。尿常规：酮体3+、pH 6.0。粪常规正常。肝肾功能、心肌酶、血糖及电解质均正常。血碳酸氢盐10.5 mmol/L（正常值：22~27 mmol/L），提示代谢性酸中毒。血酮体9.5 mg/dL（正常值：0~3.12mg/dL）；血氨69 μmol/L（正常值：9~33 μmol/L）。头部MRI：双侧半卵圆中心、放射冠、基底节、丘脑、脑干及双小脑半球对称性异常信号，考虑代谢性疾病（图 1D~F）。入院第2天采血行串联质谱检测，显示亮氨酸2 971.6 μmol/L（正常值： < 375 μmol/L）、缬氨酸500 μmol/L（正常值 < 325 μmol/L），均显著升高。
治疗经过：入院后予配方奶喂养及控制感染、补液等对症支持等治疗，第2天体温正常并发现尿液有枫糖浆气味；结合血串联质谱检测结果，于第3天临床诊断为枫糖尿病，给予去除BCAA的特殊配方奶粉喂养及维生素B1口服，病情无改善；入院第5天患儿家长要求放弃治疗，出院后患儿死亡。
追问病史：家系第1胎，男，生后7 d因拒乳、呕吐、嗜睡、惊厥于当地医院住院，生后13 d死亡；血串联质谱检测显示：亮氨酸3 478 μmol/L（正常值： < 375 μmol/L）、缬氨酸600μmol/L（正常值： < 325 μmol/L），均显著升高，支持枫糖尿病。家系第2胎于母亲妊娠早期流产。
1.2 基因组DNA提取取得患儿父母知情同意，采集双胎患儿及其父母外周血各2 mL，乙二胺四乙酸钠（EDTA）抗凝，采用Gentra Puregene Blood Kit（Qiagen公司生产）提取基因组DNA，提取后使用Nanodrop 2000蛋白核酸分析仪检测DNA浓度及纯度，确保DNA总量大于2 500 ng，A260/A280在1.8~2.0再进行后续实验。
1.3 分子遗传学检测进行枫糖尿病相关基因（BCKDHA，BCKDHB，DBT，DLD）的外显子编码区直接基因测序，并与参考序列做对比。4个基因参考序列分别为BCKDHA：NM_000709.3与NC_000019.9；BCKDHB：NM_000056.3与NC_000006.11；DBT：NM_001918.2与NC_0000001.10；DLD：NG_008045.1与NM_000108.4。
2 结果基因测序结果显示，双胎患儿在BCKDHB基因均发现2个突变：错义突变c.304G > A（p.Gly102Arg）和无义突变c.331C > T（p.Arg111*），均为杂合子，且c.304G > A（p.Gly102Arg）为国际上未报道过的新突变，在ESP6500、dbSNP、千人基因组数据库和HGMD数据库里均未见报道；而在BCKDHA，DBT和DLD基因的编码区未发现突变。对患儿父母的样本进行BCKDHB基因的c.304G、c.331C位点测序，发现患儿父亲携带了错义突变c.304G > A（p.Gly102Arg），患儿母亲携带了无义突变c.331C > T（p.Arg111*），均为杂合突变。见图 2。
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图 2 双胎患儿及其父母基因测序结果 双胎患儿在BCKDHB基因发现错义突变c.304G>A（p.Gly102Arg）和无义突变c.331C>T（p.Arg111*）；患儿父亲在BCKDHB基因发现错义突变c.304G>A（p.Gly102Arg），患儿母亲在BCKDHB基因发现无义突变c.331C>T（p.Arg111*）。箭头示突变位点。 |
3 讨论
MSUD是一种相对少见的氨基酸代谢病，主要分5型：经典型（新生儿型）、中间型、间歇型、维生素B1反应型、二氢脂酰脱氢酶缺乏型。新生儿期发病者常为经典型，患儿出生时大都正常，生后12~24 h出现尿液或汗液枫糖浆味，2~3 d出现酮兴奋和哺乳困难，4~5 d出现嗜睡、角弓反张、惊厥等脑病表现，如未得到及时治疗可于7~10 d出现昏迷、中枢性呼吸衰竭、死亡。中间型临床表现与经典型相同、但症状较轻，可以在新生儿期出现尿枫糖浆味和轻微症状，也可以由其他疾病诱发。间歇型常在应激情况下而诱发，发作时临床表现与经典型相似。维生素B1反应型症状较轻，对维生素B1治疗有反应。二氢脂酰脱氢酶缺乏型患儿出生时表现正常，可引起新生儿期酸中毒、肌张力低下、进行性共济失调和严重的神经受损症状和体征，多在儿童期死亡。MSUD患儿体内的BCAA如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸蓄积，对脑组织产生神经毒性而导致脑白质病变，颅脑MRI影像表现为脑发育不良、脑皮质较薄、脑室三角区白质信号异常，在新生儿期起病者头颅MRI会呈特异性脑水肿表现[4]，对疑诊患者尽早行MRI检查有助于早期诊断。
质谱分析技术是疾病筛查及确诊的有效手段，为早期发现新生儿代谢性疾病提供了有效的检测手段[5]。MSUD患者血BCAA水平明显增高，而经典型患儿血亮氨酸水平明显增高。通过串联质谱方法检测血滤纸片中氨基酸水平可早期筛查MSUD[6]；而BCKA可从尿及体液中排出，使尿2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-异己酸及乙酰甘氨酸显著高，通过气相色谱-质谱技术（GCMS）检测尿有机酸，如显著升高即可诊断为MSUD[7]。该家系第1胎生后7d出现拒乳、嗜睡、惊厥，串联质谱检测显示亮氨酸及缬氨酸显著升高，提示枫糖尿病。该双胎患儿亦在出生后7~8d出现拒乳、喂养困难、反应差，尿液枫糖浆气味，代谢性酸中毒，尿酮体阳性，颅脑MRI示脑白质病变、提示代谢性疾病，血串联质谱检测显示亮氨酸、缬氨酸均显著升高，故临床诊断为MSUD。
MSUD是一种常染色体隐性遗传病，患者的父母往往均携带致病的突变基因，他们的子女有25%的可能成为患者。BCKDH属线粒体大分子多酶复合物，含3个催化单位（4个蛋白质分子）：支链α-酮酸脱羧酶（E1）、双氢脂酰转环酶（E2）、二氢脂酰胺脱氢酶（E3），其中E1是一个杂四聚体，由2个亚单位E1α和E1β亚基组成。此外，BCKDH复合物两个特殊调节酶，特异性激酶和特异性磷酸酶，通过可逆性磷酸化调节BCKD复合物活性。这样至少有6个遗传位点编码，任何位点的编码基因都可能发生突变导致BCKD多酶复合体活性减低，从而导致MSUD的发生[8]。根据基因突变将枫糖尿病分为：Ⅰ A型（编码E1α亚基的BCKDHA基因突）、Ⅰ B型（编码E1β亚基的BCKDHB基因突变）、Ⅱ型（编码E2亚基的DBT基因突变）、Ⅲ型（编码E3亚基的DLD基因突变），Ⅳ和Ⅴ则被保留作为特异性激酶和磷酸酶基因突变型[9]。迄今已在BCKDH上发现了150多种突变[10]，以BCKDHA、BCKDHB基因突变最常见，且不同种族存在不同的热点突变，发病率最高的门诺派教徒社区最常见的突变为BCKDHA基因c.1312T > A（p.Y393N），该突变预计携带率高达10%[11]。国内沈云琳等[3]报道了1例经典型MUSD患儿的2个新BCKDHB基因突变：c.580C > T（p.Leu194Phe）和c.597T > G（p.Ser199Arg）。本研究双胎患儿在BCKDHB基因上均发现2个杂合突变：c.304G > A（p.Gly102Arg）和c.331C > T（p.Arg111*），其中c.304G > A（p.Gly102Arg）为错义突变，来自于患儿父亲，翻译产物蛋白质的第102位氨基酸由甘氨酸转变为精氨酸，经初步生物信息学分析（LRT、PolyPhen-2）显示Gly102位点在进化上保守、可能致病，但生物信息学分析结果仅供参考[12]；c.331C > T（p.Arg111*）为无义突变，来自于患儿母亲，翻译产物蛋白质的第111位氨基酸残基由精氨酸变为终止密码子，该突变预计会导致所编码的蛋白质发生截短，使E1β亚基发生空间构象变化、氨基酸酸碱度变化等诸多改变，进而影响脱氢酶的活性，从而致病，有文献报道为致病突变[13]。本研究结果显示，双胎患儿基因突变存在于BDKDHB基因上，确诊为MSUD Ⅰ B型。
本病目前尚无特异而有效的治疗措施，治疗目的在于迅速排出体内的支链氨基酸及代谢产物，中枢神经系统受损的程度取决于治疗是否及时[14]。经典型MSUD最佳治疗时机是出生7d以内，早期治疗者1/3的患儿智力评分可达正常，而出生14d以后开始治疗者预后差[15]。腹膜透析是有效的治疗方法，同时限制蛋白和支链氨基酸入量，静脉补充足够的热量防止机体分解产生更多的氨基酸，给予大剂量维生素B1（硫胺素），采取适量母乳和去除BCAA的特殊奶粉混合喂养[16]，并定期监测血氨基酸浓度以调整饮食的比例。已有在MSUD哺乳动物模型中开展肝细胞移植的研究，MSUD肝脏移植后不需限制饮食，但受到供体来源、费用、手术风险和并发症的限制，肝细胞移植则较好地克服了以上缺点[17]。该双胎患儿明确诊断后立即给予特殊配方奶粉、同时给予维生素B1治疗，但患儿家长要求放弃治疗，放弃后死亡。
MSUD是致死、致残的遗传性疾病，治疗困难，预后不良。患者多在新生儿期发病，病情危重，早期诊断、尽早进行饮食和治疗干预对治疗至关重要。对于新生儿期不明原因的喂养困难、嗜睡、反应差、惊厥、甚至昏迷以及有异常尿液气味等，应尽早行颅脑MRI检查，进行血串联质谱的筛查有利于MSUD的早期诊断；对MSUD患者进行基因诊断，可以预测疾病的严重程度，有助于开展遗传咨询工作。
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