10日龄Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠购自成都达硕医学实验动物有限公司。pcDNA3.1（大连宝生物工程有限公司），TERT真核表达质粒pcDNA3.1-TERT由本实验室构建储存。兔抗TERT抗体、ECL化学发光底物（Millipore公司，美国）；兔抗活化型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase 3, CC3）抗体、兔抗凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor, AIF）抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，瑞士）；小鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（成都正能生物技术公司）。电泳系统、转印系统、化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国）；动物缺氧舱（杭州艾普仪器设备有限公司）；侧脑室微量注射器（汉密尔顿公司，瑞士）。

先将24只发育健康、喂养良好的10日龄SD新生大鼠进行模型验证，分为假手术组、HI 4 h组、HI 24 h组和HI 72 h组，每组6只。模型验证成功后，再取48只SD新生大鼠分为假手术组、HIBD组、空质粒组和TERT组，每组12只，其中每组取3只用于Western blot检测，取9只用于TUNEL染色。

采用乙醚吸入法进行动物麻醉。将新生大鼠仰卧位固定于实验台上，医用碘伏消毒颈部皮肤，在颈部正中偏右作长约0.5 cm的纵向切口，用眼科镊分离右侧颈总动脉（尽量避免损伤与血管伴行的迷走神经），采用5#手术缝合线双结结扎右侧颈总动脉，并在双结之间剪断，缝合皮肤切口，放回母鼠处休息1 h，然后将大鼠放入缺氧舱中，8%氧气和92%氮气的低氧混合气通气2.5 h，制作HIBD动物模型^[6]。假手术组仅分离右侧颈总动脉，不结扎，不进行低氧处理。

HI后0.5 h进行侧脑室注射给药，空质粒组注射pcDNA3.1，TERT组注射pcDNA3.1-TERT，注射剂量均为5 μL。动物经乙醚麻醉后俯卧位固定于实验台上，对耳线前缘作头皮正中切口，暴露前囟，在前囟向后2 mm，矢状缝向右2 mm处作为侧脑室注射位点，采用汉密尔顿侧脑室注射器垂直进针3 mm，缓慢注射，推注时间10 min左右，注射完毕留针2 min，然后缓缓将注射器垂直拔出，缝合皮肤。每次注射前侧脑室注射器均用无水乙醇浸泡灭菌。

石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色3 min，蒸馏水洗涤。70%乙醇溶液分色后，伊红乙醇溶液染色3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察脑组织病理改变。

转染TERT真核表达质粒或空质粒48 h后处死动物，取各组大鼠损伤侧大脑皮层组织，用细胞裂解液提取总蛋白。行SDS-PAGE电泳，湿转法将胶中蛋白水平转移至PVDF膜上，5% BSA常温封闭30 min，用封闭液稀释TERT抗体（1：1 000）、AIF抗体（1：2 000）、CC3抗体（1：500）和内参β-actin抗体（1：5 000），室温孵育1 h，4℃过夜；TBST洗膜后，用封闭液稀释二抗（1：3 000），室温孵育1 h，TBST洗膜，在膜上滴加ECL化学发光底物，在化学发光凝胶成像系统中曝光。用Gelpro32软件分析条带灰度值，蛋白相对表达量为目的条带与β-actin条带灰度值的比值。

HI后24 h大鼠麻醉后灌注取脑，脑组织震动切片，切片厚度为40 μm，每个脑组织样本随机选取3张切片，以新鲜配置的细胞通透液（用0.1%柠檬酸钠配置的0.1% Triton X-100）常温处理5 min，加TUNEL反应液，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次，DAPI染液常温孵育15 min，用抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下随机选取5个视野观察，采集图像。计数凋亡细胞；计算凋亡指数（apoptosis index, AI）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

假手术组大脑皮层中神经细胞与周围组织间无间隙，细胞核浆比例正常，排列有序（图 1A）。HI后大脑皮层组织出现不同程度的病理改变。HI 4 h时，大量细胞呈嗜酸性染色变，有的细胞与周围组织间隙增宽，组织结构相对疏松，细胞排列略紊乱（图 1B）；HI 24 h时，细胞数目减少，许多神经细胞皱缩，与周围组织间隙明显增宽，细胞排列更加紊乱（图 1C）；HI 72 h时，皱缩细胞增多，仍有大量嗜酸性变的神经细胞，细胞排列依然紊乱（图 1D）。表明HIBD模型建立成功，可用于后续实验研究。

图 1 HIBD大鼠脑组织病理学改变 （苏木精-伊红染色，×200）A：假手术组；B：HI 4 h组；C：HI 24 h组；D：HI 72 h组。假手术组大脑皮层神经细胞结构正常、排列整齐，与周围组织无间隙；HI后各时间点大脑皮层神经细胞数目减少、呈嗜酸性变、排列紊乱，与周围组织间隙增宽。

与假手术组相比，HIBD组、空质粒组和TERT组大脑皮层中TERT蛋白的表达均有所增加（P < 0.01）；与空质粒组和HIBD组相比，TERT组TERT蛋白的表达明显上调（P < 0.01），表明侧脑室注射TERT真核表达质粒可明显上调HIBD大鼠大脑皮层中TERT蛋白的表达；HIBD组和空质粒组比较，TERT蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）。与假手术组相比，空质粒组和HIBD组AIF蛋白表达均明显增加（P < 0.01），TERT组AIF蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）；与空质粒组和HIBD组相比，TERT组AIF蛋白表达明显减少（P < 0.01），表明转染TERT可抑制HIBD大鼠大脑皮层中AIF的表达；空质粒组与HIBD组间比较，AIF蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）。与假手术组相比，空质粒组和HIBD组CC3蛋白表达均明显增加（P < 0.01），TERT组CC3蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）；与空质粒组和HIBD组相比，TERT组CC3蛋白表达明显降低（P < 0.01），表明转染TERT可抑制HIBD大鼠大脑皮层中caspase3蛋白的激活；空质粒组和HIBD组间比较，CC3蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1，图 2。

表 1

表 1 各组新生大鼠大脑皮层中TERT、AIF和CC3蛋白的表达比较（n=3，x±s）

表 1 各组新生大鼠大脑皮层中TERT、AIF和CC3蛋白的表达比较（n=3，x±s）

图 2 Western blot法检测转染TERT对HIBD新生大鼠大脑皮层中TERT、AIF和CC3表达的影响 A：Western blot电泳图；B：TERT蛋白相对表达量柱状图（n=3），C：AIF蛋白相对表达量柱状图（n=3），D：CC3蛋白相对表达量柱状图（n=3）。a示与假手术组比较，P < 0.01；b示与空质粒组和HIBD组比较，P < 0.01。

激光共聚焦显微镜下观察各组新生大鼠神经细胞TUNEL染色结果，凋亡神经细胞胞核呈绿色。结果显示：各组凋亡指数比较差异有统计学意义（F=193.2，P < 0.0001）。与假手术组（2.4%±0.6%）相比，HIBD组（52.8%±4.4%）、空质粒组（51.9%±7.0%）和TERT组（22.7%±6.4%）细胞AI值均显著增加（P < 0.01）；与空质粒组和HIBD组相比，TERT组细胞AI值明显降低（P < 0.01），表明上调TERT水平可明显抑制HI诱导的神经细胞凋亡；而空质粒组和HIBD组间比较AI值差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。

图 3 TUNEL法检测各组新生大鼠神经细胞凋亡情况（×400 左列为DAPI染色，中间列为TUNEL染色，右列为DAPI和TUNEL染色融合图。凋亡细胞呈绿色荧光。假手术组偶见凋亡细胞，HIBD组和空质粒组凋亡细胞较多，TERT组凋亡细胞数明显减少。

HIE是各种围产期因素引起的脑缺氧或缺血导致的急慢性脑损伤，具有极高的病死率和致残率。流行病学资料显示，即使发达国家，HIE仍是导致围生期死亡及儿童致残的主要原因^[7]。据统计，HIE致残率在西方发达国家为1‰~8‰，在发展中国家为26‰^[8-9]。HIE的后遗症表现为脑瘫、失明失聪、智力障碍等，严重影响患儿及家人的生活质量，给社会带来严重经济负担^[10]。目前，新生儿HIE发病及修复机制尚未阐明，临床治疗手段局限于对症支持治疗，尚缺乏安全有效的HIE后遗症防治措施。迄今，亚低温疗法是缓减HIE症状，改善中重度HIE患儿预后的唯一有效的治疗措施^[11-13]。科学家们对亚低温治疗的安全性及有效性尚存在争议^[14-15]，现有研究成果尚不能证实亚低温疗法可降低HIE的病死率及致残率。因此，深入探讨新生儿HIE的发生发展机制及损伤后修复机制，探索行之有效的治疗方法具有重要意义。

HIBD模型是经典的HIE的疾病模型。新生10日龄SD大鼠脑发育程度更接近于人类足月新生儿。因此，本研究采用10日龄SD大鼠为研究对象，在Rice法基础上加以改良，制备HIBD动物模型，以模拟足月新生儿脑损伤的变化过程。细胞凋亡是HIBD中神经细胞死亡的主要形式。脑组织发生HI时，能量锐减，细胞膜上Na+-K+-ATP泵功能衰竭、大量钠钙离子内流，线粒体膜通透性转运孔异常开放，AIF和细胞色素C释放，大量氧自由基和兴奋性氨基酸堆积，导致细胞凋亡。研究表明，细胞凋亡在HI损伤后数十分钟内发生，24~48 h达高峰，可持续数周^[16]。细胞凋亡是一种慢性可逆的过程，很多因素可以阻断或减少凋亡的发生。因此，早期阻断细胞凋亡，减轻HIBD，已成为研究HIE治疗措施的重要途径。

TERT是端粒酶的催化亚基，其经典作用是维持端粒长度和延长细胞寿命。在中枢神经系统，TERT主要表达于胚胎期神经前体细胞和生后早期的神经元中^{[3, 17]}，随着神经细胞分化成熟，TERT表达逐渐降低，在出生后5 d几乎检测不到^[18-19]。Baek等^[20]在大脑中动脉栓塞动物模型的研究中发现，缺血性损伤能诱导TERT表达增加。本课题组前期研究结果显示，TERT蛋白表达在HI后4 h即开始增加，24~48 h达高峰^[21]，提示TERT可能在HIBD中发挥着重要作用。研究表明，TERT能通过抵抗N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）兴奋性神经毒作用、改善线粒体功能、减少Ca2+内流、抑制氧自由基产生等多种机制，发挥神经保护作用^{[4, 22-23]}。抑制TERT表达可促进HI诱导的细胞凋亡，加重脑损伤^[24]。既往研究中，本课题组采用反义寡核苷酸的方法抑制新生鼠脑组织中TERT的表达，发现抑制TERT后脑组织中CC3蛋白表达及细胞AI值均显著增加^[5]，提示TERT在HIBD中具有抗细胞凋亡作用。本研究中，我们应用TERT真核表达质粒上调脑组织中TERT的表达，发现上调TERT水平可有效抑制HI引起的细胞凋亡，进一步证实TERT可能是HIBD过程中重要的神经保护分子，上调TERT有利于改善HIBD。由于本实验样本量小，观察时间仅为2 d，因此，TERT基因治疗HIBD的远期治疗效果及安全性问题尚需深入研究分析。此外，TERT基因转染效率以及治疗时间窗等问题也有待进一步研究探索。