新生儿缺氧性肺动脉高压（hypoxia induced pulmonary hypertension,HPH）是临床常见的急危重症，早期肺血管痉挛，及时治疗可逆；晚期肺血管重塑，临床治疗受限，救治困难，病死率高。本课题组以往的研究表明缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是新生大鼠HPH发病机制中的重要因子^[1]，近年有研究表明热休克蛋白70（heat shock protein,HSP70）能够在长期缺氧状态下降低HIF-1α的稳定性，促进HIF-1α的降解^[2]。然而，目前国内外关于HSP70对HIF-1α降解作用的研究集中在肿瘤等领域^{[3, 4]}，而关于HSP70能否在新生儿HPH中延缓HPH的发生发展，未见相关报道。本研究在前期研究的基础上，以HSP70基因为目的基因，借助基因转染技术对HPH新生大鼠肺组织进行外源性基因修饰，以提高肺组织HSP70的表达，观察HSP70基因转染后HPH新生大鼠肺动脉压力、肺血管结构及重塑指标改变的情况，以了解HSP70是否可降低HPH新生大鼠肺动脉压力、减轻其肺血管重塑，为进一步研究新生儿HPH新的治疗方法提供依据。

选取7~10日龄健康、清洁Wistar新生大鼠[实验动物许可证号：SCXK（新）2011-0004]128只，体重27±3 g，均由新疆医科大学第一附属医院医学研究中心实验动物研究部提供。氧浓度仪（CY-100B型）由杭州利华科技有限公司提供；小动物呼吸机（HX-200型）由成都泰盟科技有限公司提供；光学显微镜（BX41TF）由日本奥林巴斯公司提供。Ad-HSP70（纯化）及Ad-GFP（纯化）由上海汉恒生物科技有限公司提供，兔抗鼠HSP70多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，二抗为山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体由中杉金桥生物工程有限公司提供。

将128只Wistar新生大鼠按随机数字表法分为HPH模型组（简称HPH组，n=96）和空白对照组（n=32），其中，HPH组根据转染液不同再分为盐水组、空病毒组（标有绿色荧光信号但未携带目的基因的病毒载体）和病毒+HSP70组（标有绿色荧光信号同时携带目的基因的病毒载体），每组32只大鼠。病毒+HSP70组经大鼠尾静脉注入5 μL 5×10¹⁰ PFU/mL AD-HSP70，空病毒组经大鼠尾静脉注入5 μL 5×10¹⁰ PFU/mL AD-GFP，盐水组经大鼠尾静脉注入5 μL生理盐水。

按照本课题组前期建立新生大鼠HPH模型的方法^[5]，将HPH组新生大鼠转染后连同母鼠置于常压低氧舱内，以1.5 L/min的速度将8%氧浓度的氮氧混合气输入低氧舱，用氧浓度测定仪监测舱内氧浓度，使其维持在10%±0.5%，舱内置小风扇，以保证舱内氧浓度均匀。低氧舱内放置钠石灰和无水氯化钙以吸收二氧化碳与水蒸气。温度传感器检测舱内温度使其恒定在 22~24℃。 昼/夜比为12 h/12 h，每天缺氧8 h。空白对照组常规饲养。分别于缺氧3、7、10、14 d检测各组新生大鼠的肺动脉压力及肺血管重塑指标，每个时间点每组处死8只新生大鼠。

所有入组新生大鼠测定完肺动脉压力后立即处死取其右中叶肺组织（3~5 mm×3~5 mm× 10~15 mm）。为避免破坏肺组织结构，采集肺组织标本时应注意动作轻巧，避免挤压、损伤肺组织；将切取的右中叶肺组织标本投入生理盐水中洗净血液，然后投入预先配制好的4%多聚甲醛液中固定2 h，再用0.1 mmol/L的PBS液体洗3次，每次5 min；然后将标本置于15%的蔗糖中过夜；最后至于固定液中放入-20℃冰箱备用。将预先备好的标本做冰冻切片，注意避光，并在20 min内放于免疫荧光显微镜下观察，并采集图片。

取大鼠右下叶肺组织，4%甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片常规脱蜡，抗原热修复。每只大鼠肺组织制作8张切片。采用兔抗鼠HSP70多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，免疫组化法测定肺组织HSP70蛋白表达。每个步骤均严格按照试剂盒说明书操作。3,3'-二氨基联苯二胺盐酸盐（0.01 mol/L）显色，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。阳性标记强度计分：依照细胞阳性着色程度，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；每张切片随机观察5个高倍镜视野，依照阳性细胞数量阳性细胞总数为1%~25%计1分，阳性细胞总数为26%~50%计2分，阳性细胞总数为 51%~75%计3分，阳性细胞总数>75%计4分，着色强度计分与阳性面积率计分之积为最后总分：0分（-），1~2分（+），3~4分（2+），>4分（3+）。

各组新生大鼠经氯胺酮（75 mg/kg）、阿托品（0.375 mg/kg）和地西泮（7.5 mg/kg）混合液腹腔内注射麻醉后，固定、备皮、消毒气管及胸部皮肤，行气管插管，给予机械通气，小动物呼吸机参数设置为呼吸频率100~110次/min、吸呼比1 : 1.5、潮气量5~7 mL/min。监测实验新生大鼠尾部血氧饱和度，使其维持在85%~95%。从胸骨右缘行U型切口打开胸腔（右至胸骨右缘约0.3 cm，左至胸骨左缘约0.5 cm，下至剑突下缘），充分暴露肺动脉根部，用4.5号针头逆血流方向小心刺入肺动脉根部，针头的另一端连接记录仪压力传感器，记录平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure,mPAP）。

取Wistar 新生大鼠右上叶肺组织，4%多聚甲醛固定1周。常规石蜡包埋，连续切片，制备好的石蜡切片常规脱蜡脱水，每只大鼠随机选3张肺组织切片行苏木精-伊红（HE）染色，每张切片随机选取与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的横断面积较圆、直径为5~10 μm的肺小动脉3支，在光镜下观察形态学变化。用病理图像分析软件测定肺小动脉中层壁厚（MT）、肺小动脉外径（ED）、管壁中层横截面积（MA）和血管总横截面积（TAA），根据公式MT%=MT/ED×100%、MA%=MA/TAA×100%计算，将MT%、MA%作为肺血管重塑指标。

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用SNK-q检验；不满足正态分布的计量资料采用中位数（四分位间距）[P₅₀（P₂₅，P₇₅）]表示，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验；等级资料采用例数表示，多组间比较采用秩转换后的Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验。P<0.05为差异有统计学意义。

取空病毒组及空白对照组肺组织冰冻切片于免疫荧光显微镜下观察，发现缺氧3、7、10 d时空病毒组肺组织均可见免疫荧光；缺氧14 d时未见明显免疫荧光（图 1）。表明经尾静脉途径注射的腺病毒成功定位于新生大鼠肺组织，随着缺氧时间延长，腺病毒在肺组织内逐渐衰减。

图 1 免疫荧光法观察空病毒组肺组织中腺病毒定位（GFP，×200） 空病毒组肺组织在缺氧3 d 时可见明显 绿色荧光，随着时间延长，空病毒组绿色荧光逐渐减退，至缺氧14 d 时绿色荧光消失。

缺氧3、7、10 d 盐水组、空病毒组、病毒+ HSP70组肺组织HSP70表达均强于空白对照组（P<0.01），其中病毒+HSP70组HSP70表达强于与盐水组和空病毒组（P<0.01），但在盐水组和空病毒组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；缺氧14 d时各组间HSP70表达强度比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2，表 1。

图 2 新生大鼠肺组织中HSP70 表达（DAB 显色，×200） 缺氧3、7、10 d 病毒+HSP70 组HSP70 表达强于其余3 组， 随着缺氧时间延长，HSP70 逐渐衰减，至缺氧14 d 时，4 组间HSP70 表达无明显差异。HSP70 阳性表达呈棕黄色。

表 1(Table 1)

表 1 4 组新生大鼠HSP70 免疫组化反应强度比较 （鼠数）

表 1 4 组新生大鼠HSP70 免疫组化反应强度比较 （鼠数）

盐水组及空病毒组缺氧3、7、10、14 d时的mPAP水平比同日龄空白对照组均显著增高（P<0.05）。病毒+HSP70组缺氧3、7、10 d时的mPAP水平与同日龄空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与同日龄盐水组及空病毒组比较显著降低（P<0.05）。病毒+HSP70组缺氧14 d时mPAP水平与同日龄盐水组及空病毒组比较差异无统计学意义（P>0.05），但高于空白对照组（P<0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 4 组新生大鼠mPAP 比较 [P50（P25，P75）]

表 2 4 组新生大鼠mPAP 比较 [P50（P25，P75）]

空白对照组新生大鼠肺小动脉管壁薄；盐水组和空病毒组新生大鼠缺氧3 d时肺小动脉管壁均明显增厚，缺氧7 d时，呼吸性细支气管水平肺小动脉平滑肌层增厚，管壁增厚，官腔缩小，缺氧10 d及14 d时可见肺小动脉中层平滑肌增生，管壁增厚，官腔更加狭小；病毒+HSP70组在缺氧3、7、10 d时肺小动脉中层平滑肌未见明显增生，管壁增厚不明显，官腔狭小不显著，在缺氧14 d时肺小动脉中层平滑肌增生，管壁增厚，官腔狭小，提示病毒+HSP70组肺血管结构改变较盐水组和空病毒组延迟并且程度较轻。见图 3。

图 3 缺氧后新生大鼠肺组织形态学（苏木素- 伊红染色，×200） 空白对照组新生大鼠肺小动脉管壁薄。盐水 组和空病毒组随着缺氧时间延长，肺小动脉管腔逐渐缩小，管壁增厚。病毒+HSP70 组在缺氧3、7、10 d 时肺小动脉管腔无 明显缩小，管壁增厚不显著；在缺氧14 d 时肺小动脉管壁增厚，官腔狭小。

盐水组和空病毒组在缺氧3 d时MT%和MA%与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；缺氧7、10、14 d时MT%和MA%较空白对照组明显增高（P<0.05）；但此两组间比较差异无统计学意义（P>0.05），提示此盐水组和空病毒组缺氧7 d时开始出现肺血管重塑。病毒+HSP70组在缺氧3、7、10 d时MT%和MA%与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在缺氧7、10 d时MT%和MA%低于盐水组和空病毒组（P<0.05）；缺氧14 d时与盐水组和空病毒组比较差异无统计学意义（P>0.05），但高于空白对照组（P<0.05）。提示病毒+HSP70组肺血管重塑在缺氧14 d时出现，较盐水组和空病毒组晚。见表 3~4。

表 3(Table 3)

表 3 4 组新生大鼠MA% 变化 （ x±s，%）

表 3 4 组新生大鼠MA% 变化 （ x±s，%）

表 4(Table 4)

表 4 4 组新生大鼠MT% 变化 （ x±s，%）

表 4 4 组新生大鼠MT% 变化 （ x±s，%）

新生儿HPH，救治困难，病死率高，其发病机制有待进一步研究。本课题组前期研究发现，HIF-1α在新生儿HPH的发病机制中发挥了关键作用^[5]，通过促进下游靶基因的表达^[6]，使肺血管内皮损伤，肺血管痉挛及重塑，参与肺动脉高压的形成^[7]。HSP又称为应激蛋白或热应激蛋白，具有高度保守性，它普遍存在于整个生物界，几乎所有的细胞均能合成HSP。HSP70在正常情况下表达量很少，而在缺氧等应激刺激状态下表达明显升高，并且在细胞浆和细胞核内均有表达^{[8, 9]}。主要参与细胞内蛋白质的合成、运输、折叠和蛋白质的降解调控过程，可提高细胞对应激原的耐受性，使细胞维持正常的生理功能^[10]。近年又有研究表明HSP70能够在长期缺氧状态下降低HIF-1α的稳定性，促进HIF-1α的降解^[2]，从而降低肺动脉压力，减轻肺血管重塑。相关研究局限于成人肿瘤等领域，在新生儿HPH是否有同样作用国内外未见相关报道。

本研究中，盐水组及空病毒组缺氧新生大鼠在缺氧3、7、10、14 d时mPAP均高于空白对照组，提示肺动脉高压形成，造模成功。另外，经大鼠尾静脉途径注射Ad-HSP70对HPH新生大鼠肺组织进行外源性基因修饰，病毒+HSP70组HSP70表达较其余3组明显增多，表明可以利用重组腺病毒介导外源性HSP70基因转染至HPH新生大鼠肺组织中，转染成功，提高了肺组织中HSP70的表达，为本课题的研究提供了保证。

HPH的形成主要与低氧性肺血管收缩和肺血管重塑有关。目前认为肺血管重塑是肺动脉高压持续发展的关键因素，决定着肺动脉高压的持续存在与发展。本课题组前期研究发现，Wistar大鼠乳鼠在缺氧3~5 d时为肺血管痉挛阶段，此过程为可逆性改变，若缺氧及时纠正，可以避免肺血管重塑；而缺氧7 d以上，肺血管重塑难以避免，将发生不可逆改变，预后不良^[11]。本研究结果显示，盐水组及空病毒组在缺氧3 d时肺动脉处于收缩状态，出现mPAP增强；在缺氧7 d时肺动脉结构发生改变，主要包括肌型小动脉中膜增生肥厚、无肌型动脉肌化等，导致肺血管重塑的改变^[12]，mPAP进一步增强。

本研究结果显示，盐水组及空病毒组在缺氧3、7、10 d时HSP70阳性率高于空白对照组，考虑与缺氧后HSP70转录因子明显激活一致，此为内源性表达结果，而在缺氧14 d，三组间HSP70阳性率表达差异无统计学意义，表明随肺组织缺氧时间延长，细胞结构和功能破坏，10 d内肺组织的应激和抗损伤能力较强，因而可产生HSP70以进行抗损伤和修复，随着缺氧时间延长，肺组织细胞受损加重，能够产生HSP70的能力下降。

本研究显示，在缺氧3、7、10 d时病毒+ HSP70组HSP70在肺组织中充分表达，此组mPAP与盐水组、空病毒组比较明显降低，肺血管未见明显重塑；缺氧14 d时，HSP70在新生大鼠肺组织内代谢完全，此时其mPAP较空白对照组明显增高，肺血管出现重塑；说明腺病毒介导的HSP70能减轻肺血管重塑，降低肺动脉压力。Gogate等^[8]发现HSP70在低氧条件下能够促进HIF-1α通过蛋白酶体途径降解，而利用HSP抑制剂KNK437抑制HSP70的功能后，HIF-1α的降解减少、活性增加。还有研究发现HSP70基因结构中含有缺氧诱导因子结合位点，很有可能是HIF-1α的下游靶基因，缺氧激活HIF-1α的转录活性，同时促进HSP70表达增加，表达增加的HSP70反过来激活HIF-1α的泛素化降解，成为机体细胞对缺氧反应的负反馈通路^[4]，进一步说明在缺氧状况下HSP70对HIF-1α具有泛素化降解作用，从而降低肺动脉压力，具体作用机制还需进一步研究。

本研究发现HSP70可能可以降低肺动脉压力，减轻肺血管重塑，这可能与HSP70促进HIF-1α的降解有关，本课题组正在做进一步研究。