新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE）是小儿严重的神经系统疾病，病情严重的患儿病死率高，存活者常留有脑瘫、智力低下等神经系统的后遗症。其发病机制尚不完全明确，临床治疗亦缺乏特异性的治疗方案^[1]。研究认为细胞坏死、凋亡及自噬是神经元细胞死亡的主要方式。凋亡及自噬为延迟发生，给临床治疗带来了时间窗。明确自噬及凋亡在HIE 的作用及机制，是寻找治疗靶点的关键。多项研究提示多种死亡机制参与了脑缺血后神经元损伤^{[2, 3]}。自噬及凋亡发生的具体机制尚不明确，但是抑制自噬及抗凋亡可逆转神经元损伤，提示抑制自噬及抗凋亡可能成为治疗HIE 的新思路^[1]。

PINK1（phosphatase and tensin homolog deletedon chromosome ten induced putative kinase 1） 是一种蛋白激酶，存在于线粒体外膜，在一些高能耗的组织器官，如心、脑、肌肉中高表达^[4]。研究发现PINK1能够调控线粒体自噬^{[5, 6, 7]}。越来越多的研究显示线粒体自噬参与了细胞程序性死亡^{[8, 9, 10]}。PINK1可以通过磷酸化丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2来促进细胞凋亡^[11]；在慢性阻塞性肺病的小鼠模型中，敲除PINK1基因能够明显抑制细胞自噬发生^[12]。因此我们推测PINK1可能参与了HIE 过程中的细胞自噬及凋亡的过程。本研究通过建立新生小鼠缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）模型，模拟HIE 发病过程，通过敲除小鼠PINK1基因，检测小鼠缺血缺氧脑组织中细胞凋亡及自噬情况，研究PINK1基因的敲除对新生小鼠脑损伤中凋亡及自噬的作用，为HIE 的发病机制及寻找新的治疗靶点提供基础实验依据。

8% 氧气和92% 氮气混合气（四川大学华西第二医院中央供气站）；2,3,5- 氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma，美国）；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（北京天根生化科技公司）；ECL 底物化学发光试剂（Pierce 公司，美国）；BCA 蛋白定量检测试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；原位细胞凋亡检测试剂盒（AP，Roche）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（O.Roche 公司，瑞士）；兔抗鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 抗体（SantaCruz 公司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；兔抗鼠活化型半胱天冬酶-3（CC3）抗体（CST 公司，美国）；兔抗鼠LC3抗体（Novus 公司，美国）；荧光标记山羊抗兔IgG 抗体（GeneCopoeia 公司，美国）；4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚（DAPI）染液（上海碧云天生物技术有限公司）；引物的设计与合成由苏州金唯智生物科技公司完成。

10日龄野生型（PINK1+/+）新生C57BL/6小鼠和PINK1基因敲除型（PINK1-/-）新生C57BL/6小鼠各72只，雌雄不限，由四川大学华西第二医院姜长安实验室提供。野生型和基因敲除型新生小鼠均分为假手术组及模型组，即野生型假手术组（wild-type sham-operated group,SWT）、野生型模型组（wild-type model group,MWT）、基因敲除假手术组（knock-out sham-operated group,SKO）以及基因敲除模型组（knock-out model group,MKO），每组36只。

通过改良Rice-Vannucci 法^[13] 建立新生小鼠HIBD 模型。将C57BL/6小鼠进行术前称重及编号，乙醚麻醉，于手术台上固定；常规消毒铺巾，颈部正中偏右作长约6 mm 切口；分离并用5-0丝线双重结扎右侧颈总动脉；缝合皮肤切口，术后恢复1 h，然后放入缺氧舱中给予含8% 氧气和92%氮气混合气2.5 h（氧流量2 L/min），即为HIBD模型。而后置于常氧母鼠笼中饲养。假手术组仅作颈部皮肤切口分离右侧颈总动脉，不予结扎，缝合切口，不做缺氧处理。操作过程保持恒温。

用高压灭菌1.5 mL 离心管，加入适量50 mMNaOH，酒精消毒鼠尾及器械后，剪尾尖1~2 mm置于其中，100℃水浴40 min，观察组织基本溶解时涡漩数秒，加入1 mol/L tris-HCl（pH：8.3），涡漩数秒后14 000转/min 离心5 min，取上清即得基因组DNA。取1 μL DNA 分别加入引物、2×Master Mix 等组成26 μL 反应体系。Pink1引物序列：Common：5'-GAGCCTGAAGTGCAAACTCC-3'；WT：5'-GCTCTGGCTTCTGAGGAAGA-3'；KO：5'-CTAAAGCGCATGCTCCAGAC-3'。反应条件：95 ℃ 预变性2 min；95 ℃ 变性15 s，64 ℃ 退火15 min，72 ℃ 延伸75 s，3个循环；95 ℃ 变性 15 s，61℃退火15 min，72℃延伸75 s，3个循环；95℃变性15 s，58℃退火15 min，72℃延伸75 s，3个循环；95℃变性15 s，55℃退火15 min，72℃ 延伸75 s，33个循环；最后72℃延伸75 s。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪长波紫外光下观察条带结果。野生型小鼠扩增片段为350 bp。

缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠麻醉后，直接取脑，将脑组织放置于脑切片模具中，-20℃冻10~15 min。从视交叉开始沿冠状位向后切片，切片厚度为2 mm。切片后置于2% 浓度的TTC 中，37℃温箱孵育30 min，期间保证脑片均匀接触染液，多聚甲醛固定后观察结果。染色结果红色为正常组织，白色为梗死组织。每个脑组织标本选取4张脑片评估梗死程度，梗死体积通过梗死面积积分公式计算得到^[14]。

缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠脑组织，固定后放入包埋模框，填入琼脂糖，待琼脂糖完全凝固，修理琼脂糖模块，将组织块固定到托盘上，于震荡切片机上切片，厚度为40 μm，挑片，置于6孔板中，PBS 洗5 min×3，于含0.1% TRITON X-100的0.1% 柠檬酸钠溶液中冰上作用5 min，PBS 洗5 min×3，按比例滴加TUNEL 反应液，37 ℃ 作用1 h，PBS 洗5 min×3，加入DAPI 孵育5 min，PBS 洗5 min×3，滴加抗荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜（Olympus 公司，日本）下观察结果，每个标本观察3张脑组织切片，每张脑组织切片随机选取3~4个视野，计数凋亡细胞，计算凋亡指数=（凋亡细胞/ 总细胞数）×100％。

缺氧缺血后24 h，每组分别取9只小鼠脑组织，常规固定、脱水、包埋制做石蜡切片。将切片脱蜡，梯度酒精水化，微波抗原修复，PBS 充分淋洗后，3% H2O2封闭内源性过氧化氢酶室温避光10 min，PBS 充分淋洗后，山羊血清封闭20 min，加兔抗小鼠CC3抗体（1 : 150）4℃过夜。PBS 充分淋洗后，滴加生物素化的抗兔IgG 抗体孵育20 min，PBS充分淋洗后，滴加HRP- 链酶卵白素，37℃孵育20 min，PBS 充分淋洗后，DAB 显色，适时终止显色， 苏木素复染，适时终止显色，脱水后中性树脂封片，于光学显微镜下（Olympus 公司，日本）观察、拍照。镜下阳性细胞显色为棕黄色。每个标本观察3张脑组织切片，每张脑组织切片随机选取3~4个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对其进行定量分析。

缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠脑组织，固定后放入包埋模框，填入琼脂糖，待琼脂糖完全凝固，修理琼脂糖模块，将组织块固定到托盘上，于震荡切片机上切片，厚度为40 μm，挑片，置于6孔板中，PBS洗5 min×3，于含0.3% TRITON X-100的PBS 溶液中作用30 min，PBS 洗5 min×3，封闭液封闭1 h，置于4℃冰箱，滴加一抗孵育过夜；滴加荧光素标记的二抗，湿盒避光室温孵育1 h；PBS 洗5 min×3，加入DAPI 孵育5 min，PBS 洗5 min×3，滴加抗荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜下观察结果、拍照。

LC3是自噬过程中的关键调控蛋白，当细胞自噬被激活时，在Atg4调控下由LC3- Ⅰ型蛋白向LC3- Ⅱ型蛋白（膜结合形式）转变，对自噬体的形成起关键调控作用，LC3- Ⅱ与LC3- Ⅰ的比值常用作检测细胞自噬启动程度的指标^{[15, 16]}。因此本研究采用Western blot 法进一步检测比对两组脑组织中LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ的比值。缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠右侧脑组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度至同一浓度，以60 μg/ 孔上样，在12% 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶中110 V电泳90 min 后，以0.3 A 转膜70 min 将蛋白转印至PVDF 膜上。5% 脱脂牛奶室温下封闭1h加入一抗，置于摇床室温孵育1h4℃过夜。β-actin抗体作为内参。TBST 洗膜3次，每次7 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，每次7 min。在膜上加ECL 发光剂，将膜放入凝胶成像仪成像。采用Quantity one 4.6.2（美国）软件行定量分析。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料采用均数± 标准差（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。P<0.05为差异有统计学意义。

PCR 结果表明，野生型（PINK1^+/+）小鼠出现一条350 bp 的条带，基因敲除型（PINK1^-/-）小鼠未出现350 bp 的条带，见图 1。

图 1

图 1 野生型和基因敲除型新生小鼠PINK1基因的 表达 野生型（PINK1+/+）小鼠PINK1基因扩增片段长度为 350 bp（箭头所示），PINK1基因敲除（PINK1-/-）小鼠未扩增出 350 bp 片段。

脑组织TTC 染色结果表明：与假手术组相比，新生小鼠缺氧缺血后24h组织梗死明显。MKO组脑梗死体积占脑总体积百分数（16%±3%）低于MWT 组（31%±4%）（t=9.0，P<0.05），提示PINK1基因敲除可致新生小鼠缺氧缺血后24h组织梗死程度减轻。见图 2。

图 2

图 2 野生型和基因敲除型新生小鼠脑梗死程度比较 上图为TTC 染色结果，箭头所示为梗死区域。下图为统计图（n=9）， a 示与MWT 组相比，P<0.05。

TUNEL 结果表明：SWT 组（0.76%±0.12%）与SKO 组（0.89%±0.36%）几乎不存在细胞凋亡；与各假手术组相比，两模型组凋亡阳性细胞数均明显增加（P<0.05），且MKO 组（13.2%±2.5%）凋亡指数低于MWT 组（51.9%±3.4%）（P<0.05），提示PINK1基因敲除可致新生小鼠缺氧缺血后24h组织细胞凋亡减少。见图 3~4。

图 3

图 3 各组新生小鼠脑组织细胞凋亡指数比较（n=9） a 示与各型假手术组比较，P<0.05；b 示与MWT 组比较， P<0.05。

图 4

图 4 TUNEL 染色法检测各组新生小鼠脑组织细胞凋亡情况（DAPI，×400） SWT 组和SKO 组几乎不存在 凋亡细胞，MWT 组和MKO 组凋亡细胞均明显增加，且MKO 组凋亡细胞数明显少于MWT 组，阳性凋亡细胞呈绿色荧光。

免疫组化结果表明：SWT 组（0.011±0.002）与SKO 组（0.009±0.004）几乎不表达凋亡蛋白；与假手术组相比，MKO 组（0.0878±0.033） 和MWT 组（0.151±0.048）CC3蛋白表达明显增加（P<0.05），且MWT 组CC3蛋白表达水平明显高于MKO 组（P<0.05）。提示PINK1基因敲除新生小鼠在缺氧缺血后24h组织凋亡蛋白CC3表达明显减弱。见图 5~6。

图 5

图 5 免疫组化检测各组新生小鼠脑组织凋亡蛋白 CC3表达 （DAB 显色，×400），SWT 组和SKO 组均几乎 不表达CC3蛋白；MWT 组和MKO 组CC3蛋白表达均明显增加， CC3蛋白阳性表达呈棕色（箭头所示）。

图 6

图 6 各组新生小鼠脑组织凋亡蛋白CC3表达比较 （n=9）a 示与SWT 组和SKO 组比较，P<0.05；b 示与MWT 组比较，P<0.05。

免疫荧光结果表明：SWT 组与SKO 组自噬相关蛋白LC3荧光点数很少；与假手术组相比，两组模型组LC3荧光点数明显增多；与MWT 组相比，MKO 组LC3荧光点数减少，分布弥散，密集程度降低（图 7）。Western blot 结果表明，与SWT 组（0.206±0.049）和SKO 组（0.186±0.061）相比，MWT（0.590±0.117）和MKO 组（0.382±0.089）LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ的比值均升高（P<0.05）；且MKO组低于MWT 组（P<0.05）。提示PINK1基因敲除新生小鼠在缺氧缺血后24h组织自噬指标LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ比值明显下降（图 8）。

图 7

图 7 各组脑组织自噬相关蛋白LC3表达 （免疫荧光，×400）SWT 组和SKO 组LC3荧光点数很少；MWT 组 和MKO 组LC3荧光点数明显增多；MKO 组LC3荧光点数及聚集程度较MWT 组减少。

图 8

图 8 Western blot 检测各组脑组织自噬相关蛋白LC3 表达 上图为电泳条带图，下图为统计图（n=9），a 示与SWT 组和SKO 组比较，P<0.05；b 示与MWT 组比较，P<0.05。

细胞凋亡是缺氧缺血时脑损伤的重要机制之一，减少caspase-3表达或增加Bcl-2表达等抗凋亡手段均能对缺氧缺血性脑损伤起到保护作用^[1]。PINK1是最早在遗传性帕金森病的筛查中发现的突变基因位点^[17]。目前研究认为PINK1能够通过调节线粒体自噬调节细胞凋亡^{[9, 10, 11]}。本研究发现，野生型和基因敲除型假手术组小鼠之间凋亡指标无差异，说明PINK1基因敲除后不会诱发正常脑组织的细胞发生凋亡。与假手术组小鼠相比，缺氧缺血小鼠脑组织发生大量细胞凋亡，是缺氧缺血脑损伤细胞死亡的重要途径。敲除PINK1可以明显降低脑组织细胞凋亡的发生。我们推测敲除PINK1基因后，线粒体膜蛋白发生改变，线粒体损伤介导的细胞凋亡途径被抑制，从而抑制了细胞凋亡的发生。

无论是局灶性缺血还是全脑缺血动物模型中^{[2, 3]}，缺氧缺血均能激活脑组织细胞自噬。Puyal等^[2] 发现在新生大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中，缺血核心区自噬体指标LC3 Ⅱ水平在再灌注后2h始升高，并持续至24 h，电子显微镜下观察可见大量自噬体的形成。不同的研究结果表明，在缺氧缺血性脑损伤中，自噬激活的程度和持续时间不同，对脑组织的作用存在差异。在正常情况下及轻度缺氧缺血时，存在一定水平的自噬维持细胞稳态；而在严重缺氧缺血状态下，自噬被过度激活促进细胞死亡^{[6, 7]}。本研究发现，野生型和基因敲除型假手术组小鼠之间自噬指标无差异，说明PINK1基因敲除后不会激活正常脑组织的细胞自噬。与假手术组小鼠比较，缺氧缺血小鼠脑组织自噬明显被激活，而过度的自噬导致脑组织损伤加重。与野生模型组相比，PINK1基因敲除模型组脑组织LC3荧光点数分布弥散，点状聚集减少，密集程度降低；LC3蛋白表达减弱，同时LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化也减少，说明敲除PINK1可明显抑制细胞自噬水平。我们推测敲除PINK1后，由于线粒体外膜缺乏PINK1蛋白，细胞自噬的识别反应受到干扰，抑制了细胞自噬的发生。本研究发现了PINK1在HIBD 模型中对细胞自噬及细胞凋亡的影响，但具体的分子机制尚需进一步阐明。本研究初步揭示抑制PINK1对新生10日龄小鼠缺血缺氧脑损伤可能具有神经保护作用，为HIE 治疗提供了新思路。