2016, Vol. 18
新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD）性疾病的患儿常遗留精神运动发育障碍、睡眠觉醒周期颠倒[1]、激素内分泌节律紊乱[2] 等问题，严重影响患儿生存质量。前期研究发现：HIBD 后褪黑素（melatonin,MT）分泌降低，褪黑素受体1[3]、糖皮质激素受体[4]、胰岛素样生长因子1[5] 基因表达水平下调，而皮质酮[4]、生长激素[6] 等相关基因表达水平升高，表明缺氧缺血可导致多器官系统功能的节律紊乱。此外，越来越多的证据表明缺氧可影响钟基因的表达[7]，提示生物钟系统的紊乱也可能参于HIBD 的发病。Clock 是哺乳动物昼夜生物钟节律的一个重要正性调节因子，主要生理作用是直接影响哺乳动物节律周期性和持续性。一旦生物钟系统表达异常，常导致肿瘤、糖尿病、高血压、脂肪代谢障碍、睡眠障碍等疾病发生率的增加[8]。
松果体作为一个神经内分泌器官，既发挥中枢昼夜节律振荡器的功能，又能合成MT 而发挥内分泌输出效应。有研究发现松果体中包含了以细胞微粒子形式存在的小RNA（microRNA,miRNA）[9]，miRNA 普遍存在于真核细胞中，进化上高度保守，表达具有时空特异性。成熟miRNA 主要通过与靶mRNA 的3'- 非编码区、5'- 非编码区和编码区域的碱基互补配对抑制靶mRNA 翻译，在转录后水平调控靶基因表达[10]。目前miRNA 的研究主要集中在肿瘤疾病的诊断，最近的研究发现miRNA还是昼夜节律的重要调节因子[11]。因此，本研究拟应用miRNA 表达谱芯片、实时荧光定量PCR（RT-PCR）等相关技术来检测HIBD 新生大鼠松果体miRNA 差异表达，探索miRNA 在HIBD 节律紊乱中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组和HIBD 模型制作选择SPF 级健康7日龄Sprague-Dawley（SD）新生大鼠，雌雄不限，均在光照- 黑暗交替条件下饲养，由母鼠自由哺喂，所有实验动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
将新生大鼠随机分成HIBD 模型组和假手术组，HIBD 模型的制作根据Rice-Vannucci 法[12]，新生SD 大鼠乙醚吸入麻醉，仰卧位固定于手术板，颈部正中作1 cm 纵型切口，分离左颈总动脉并双层丝线永久性结扎，缝合切口后置于37℃暖箱中恢复2 h，然后置于37℃暖箱中的密闭常压低氧舱，给予湿化的8% 氮氧混合气2 h，流量为1.5 L/min，测氧仪监测氧浓度，模型制作完毕后送回母鼠身边饲养。假手术组仅分离出左颈总动脉，不予结扎，不予低氧处理。
1.2 miRNA 的基因芯片筛选分别取模型制造后24hHIBD 模型组和假手术组各6只大鼠，断头取脑后，低温快速分离出松果体组织，常规方法抽提RNA，分光光度仪测定RNA 浓度和纯度，所取样本OD260/OD280比值均大于1.8。应用Exiqon 公司生产的miRNA 芯片miRCURY（TM） LNA Array（v.18.0） 进行检测，对HIBD 模型组和假手术组松果体样本进行差异表达的miRNA 的筛选，操作步骤按试剂盒操作流程进行。杂交芯片图像扫描后，所得数据使用Genepix Pro V6.0软件分析，通过原始值减去背景值来修正，并用中值标准化，分别计算出两种样本中miRNA 的标准值及比值。
1.3 miRNA 的RT-PCR 验证根据miRNA 基因芯片结果，筛选出HIBD模型组较假手术组表达明显上调的miRNA 有miRNA-200a-3p、-9a-5p、-375-3p、-141-3p、-182等；表达明显下调的miRNA 有miRNA-291a-5p、-935、-125b-1-3p、-294、-204-3p 等，对其中部分miRNA 进行RT-PCR 验证。分别取模型制造后24hHIBD 模型组和假手术组各6只大鼠，松果体组织总RNA 提取方法同1.2小节。
（1）引物设计：从miRbase 中调取基因芯片筛选出的HIBD 松果体中差异性表达的miRNA序列，根据通用茎环引物法[13]，并利用PrimerPremier 5.0引物设计软件设计PCR 引物。引物序列见表 1。
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表 1 miRNA 引物序列 |
（2）cDNA 制备及RT-PCR：取2.0 μg 上述组织样本抽提的总RNA 作为初始模板，进行逆转录后，采用RT-PCR 技术测定松果体细胞中miRNA的相对表达量。PCR 反应体系内含cDNA 2 μL，2*SYBR Green PCR minaster Mix 10 μL，miRNA 上下游引物各1 μL，用去离子水补至反应体积为20 μL。按上述反应体系加样，每个样品重复3次，荧光定量PCR 仪上进行PCR 扩增，设置反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集荧光，共45个循环。循环结束后做相应的溶解曲线，运用Light Cyler480自带的软件进行实时数据收集和定量分析，记录相应Cp 值，基因相对表达量采用公式2-ΔCt 方法计算，以此判定各样本中 miRNA 表达量的差异。
1.4 miRNA-182在各组织中的表达差异基因芯片鉴定同时采用RT-PCR 方法结论一致的miRNA 确定为有意义的共同差异表达miRNA，其中miRNA-182是本研究鉴定得到的候选miRNA 之一。
miRNA 的组织分布及表达量与其功能有密切关系[14]，因此需进一步验证miRNA-182在不同组织的表达情况。取正常7日龄SD 大鼠3只，颈椎脱臼法处死后分别取肺、肠、胃、肾、大脑皮层、松果体组织，冰冻粉粹标本后，按常规方法抽提RNA，按上述方法进行cDNA 合成并行RT-PCR 检测，判定各样本中miRNA-182的表达差异。
1.5 HIBD 后松果体中miRNA-182及钟基因Clock mRNA 的表达情况本研究利用TargetScan、PicTar 和miRanda3种生物信息学分析软件预测miRNA-182下游可能的靶基因，取3者交集发现，钟基因家族中的Clock 可能是其潜在作用靶点，行RT-PCR 检测HIBD 后松果体中miRNA-182与Clock 基因有无表达变化相关性。
分别于HIBD 后0 h（ 为中午12时，余推算）、24 h、48h72 h 4个时间点（ 地点、光线均相同），每组各取6只新生大鼠，松果体组织总RNA 提取方法同1.2小节。采用RTPCR法检测松果体中miR-182及钟基因Clock 的表达水平变化。引物序列如下：钟基因Clock：F：5'-TGCCAGATCATGAGAAGATG-3'，R：5'-CGCTGCTCTAGCTGGTCTTT-3'。内参β-actin：F ： 5 ' -C C C A T C T A T G A G G G T T A C G C -3 ' ，R ：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。反应体系和反应条件同1.3小节。
1.6 统计学分析运用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料以均数± 标准差（x±s）表示，若方差齐性，则两组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析；若方差不齐，则采用Kruskal-Wallis H 检验，差异有统计学意义时采用Nemenyi 法行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miRNA 的基因芯片筛选结果根据HIBD 模型组及假手术组标准化数值，计算每个基因的差异倍数（Fold change,FC）来观察表达差异。FC>2及<0.5的共有209个miRNA表达，其中表达上调的有92个，表达下调的有117个。与假手术组相比，挑选出HIBD 造模后24h达上调倍数最高的11个miRNA 有miRNA-200a-3p、-9a-5p、-375-3p、-141-3p、-9a-3p、-182、-7a-5p、-200c-3p、-106b-5p、-30c-5p、-19b-3p； 表达下调倍数最高的10个miRNA 有miRNA-291a-5p、-935、-125b-1-3p、-294、-204-3p、-21-3p、-300-5p、-207、-665、-433-5p，见表 2。
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表 2 HIBD 组与假手术组松果体中差异表达的miRNAs |
RT-PCR 结果与芯片结果一致的有miRNA-200a-3p、-375-3p、-141-3p、-182在 HIBD 后表达明显上调，miRNA-935、-204-3p、-294在HIBD 后表达明显下调，部分结果如下（表 3）。在HIBD组与假手术组中，miRNA-182、-375-3p、-141-3p及-200a-3p 的差异表达有统计学意义（P<0.05），且本研究发现RT-PCR 检测的几个miRNA 中，miR-182在HIBD 松果体样本中稳定高表达。
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表 3 假手术组和HIBD 组新生大鼠松果体miRNA 的表达水平比较（x±s，×10-5） |
miRNA-182在正常7日龄新生SD 大鼠松果体组织中呈高表达，在肺组织中有表达，在其他脏器如胃肠、大脑皮层、肾脏中表达微量（图 1）。miRNA-182在各组织间的表达差异有统计学意义（H=16.392，P=0.006），其中miRNA-182在大脑皮层及肾组织中的表达量较松果体组织中明显减低（P<0.05），miRNA-182在大脑皮层中的表达量较肺组织中明显减低（P<0.05）。于对应时间点的假手术组（P<0.05）；而HIBD 后0 h、72 h miR-182的表达水平与对应时间点假手术组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图 2，表 4）。与对应时间点假手术组相比，HIBD 后0 hClock mRNA 表达水平升高，48h降低，72h明显升高（P<0.05）；而24 h Clock mRNA 表达水平与对应时间点假手术组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图 3，表 5）。
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图 1 miRNA-182在各组织中的表达差异 （n=3） a 示与松果体组织比较，P<0.05；b 示与肺组织比较，P<0.05。 |
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图 2 两组HIBD 后各时间点miRNA-182的表达变化 （n=6）a 示与假手术组相比，P<0.05。 |
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图 3 两组HIBD 后Clock mRNA 的表达变化 （n=6） a 示与假手术组相比，P<0.05。 |
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表 4 两组新生大鼠各时间点松果体miRNA-182的表达 水平比较（x±s，×10-4） |
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表 5 两组新生大鼠各时间点松果体Clock mRNA 的表达 水平比较（x±s，×10-4） |
Clock mRNA 的表达情况HIBD 后24 h、48 h miRNA-182的表达水平高于对应时间点的假手术组（P<0.05）；而HIBD 后0 h、72 h miR-182的表达水平与对应时间点假手术组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图 2，表 4）。与对应时间点假手术组相比，HIBD 后0 hClock mRNA 表达水平升高，48h降低，72h明显升高（P<0.05）；而24 h Clock mRNA 表达水平与对应时间点假手术组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图 3，表 5）。
3 讨论miRNA 是一类高度保守的非编码小分子单链RNA。大量研究表明miRNA 在生命发育进程中扮演着关键角色，至少能直接调控30% 的人类基因表达[15]。miRNA 参与了许多疾病的生理和病理过程，例如组织发育、组织器官形成、细胞凋亡、细胞增殖、肿瘤发生等。可见，miRNA 在机体基因表达调控中发挥着重要作用。研究发现miRNA是昼夜节律重要的调节因子，miRNA-122可以通过调节Nocturnin 基因的表达来参与肝脏昼夜节律的调节[16]，miRNA-483通过调节靶基因芳香烷基胺-N- 乙酰基转移酶来调控大鼠松果体MT 的合成[17]。因此，本研究拟探索HIBD 生理及病理过程中发挥作用的miRNA 及其作用，为进一步明确HIBD 中昼夜节律紊乱的内在分子机制提供理论依据。本研究中通过基因芯片技术检测出HIBD 后表达差异倍数明显（FC>2及<0.5）的miRNA 209个，我们从中挑选出差异表达最明显的11个miRNA进行RT-PCR 验证，两种方法结论一致的候选miRNA 确定为有意义的共同差异表达miRNA，其中miRNA-182是本研究鉴定得到的候选miRNA 之一。基因芯片筛选及RT-PCR 验证中均显示HIBD后新生大鼠松果体中miRNA-182表达上调，且与假手术组比较差异性表达有统计学意义；RT-PCR发现miRNA-182在HIBD 样本中稳定高表达，且生物信息学分析结果显示miRNA-182在进化上高度保守，提示其潜在功能的重要性。近期的研究发现，重度抑郁症患者存在miRNA-182前体形成异常，从而影响成熟miRNA-182的表达，导致患者出现失眠等节律紊乱现象[18]。以上结果提示miRNA-182可能参与了HIBD 后昼夜节律紊乱的病理生理过程。
miRNA 在组织中的表达量与其功能密切相关，明确miRNA 的组织表达量对于其功能研究很重要。肝脏组织特异性表达miRNA-122[19]，脑组织特异性表达miRNA-9[20] 和miRNA-124a[21]，横纹肌组织特异性表达miRNA-1/206和miRNA-133[22]，这些miRNA 的特异性表达与相应组织器官特殊的生理结构和功能密切相关。本研究使用RT-PCR 的方法，检测miRNA-182在主要脏器中的表达，结果发现miRNA-182在正常7日龄新生SD 大鼠松果体组织中呈高表达，在肺组织中有表达，但含量较低，在其他脏器如胃肠、大脑皮层、肾脏中表达微量。根据表达水平和功能的相关性，本研究推测miRNA-182可能参与松果体的重要病理生理过程。
认识miRNA 的作用机制，关键是认识miRNA及其靶基因的相互作用。TargetScan、PicTar 和miRanda 是目前认为常用而准确的靶基因预测软件[23]，本研究利用TargetScan、PicTar 和miRanda三种生物信息学分析软件预测miRNA-182下游可能的靶基因，取三者交集发现，钟基因家族中的Clock 可能是其潜在作用靶点，Clock 序列中的“UUGCCAAA”碱基序列和不同物种miRNA-182的保守序列“AACGGUUU”匹配。昼夜节律生物钟系统维系着机体的正常生物节律，Clock 是哺乳动物昼夜生物钟节律的一个重要正性调节因子，因此，本研究通过检测HIBD 后，不同时间点松果体中miRNA-182与Clock 的表达变化来初步明确两者的相关性。本研究通过RT-PCR 技术检测到在HIBD 后0、24、48h型组的miRNA-182表达量较假手术组升高，72h达较假手术组降低，其中24h48h差异表达有统计学意义；钟基因Clock mRNA 在HIBD 后0h达水平较假手术组升高，24 h、48 h Clock mRNA 表达降低，72 h后明显升高，其中0 h、48h72h差异表达有统计学意义。结果显示，新生大鼠HIBD 后松果体miRNA-182与Clock mRNA的表达有一定的相关性，呈负向调节，但不完全相关，考虑因机体是一个复杂的调控系统，存在众多的神经、内分泌等调控机制，所以实验数据有一定的局限性，还需体外实验等来进一步的验证。
综上所述，在HIBD 松果体损伤的病理生理过程中，miRNA 的表达有明显变化，特别是miRNA-182可能参与HIBD 后的昼夜节律紊乱，本研究为HIBD 的节律紊乱机制提供了新线索，为HIBD 的治疗提供了新的靶点。
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