中国当代儿科杂志  2016, Vol. 18 Issue (5): 431-434   PDF    
新生猪溶血性黄疸模型的制备与验证
李永富1, 马月兰1, 聂玲1, 陈爽1, 金美芳2, 王三南1     
1. 苏州市立医院本部新生儿科, 江苏 苏州 215002;
2. 苏州大学附属儿童医院儿科研究所, 江苏 苏州 215123
摘要: 目的 建立新生猪溶血性黄疸动物模型,以进一步研究新生儿溶血性黄疸的病理生理。方法 7日龄纯种大约克白猪分成实验组和对照组,每组各6只。并采用免疫新西兰大白兔的方法 制备兔抗猪红细胞抗体,分离兔抗猪红细胞血清。实验组静脉注射兔抗猪红细胞血清5mL,对照组注射5mL生理盐水。两组均每6h采血送检血常规及肝功能。结果 实验组注射兔抗猪红细胞血清18h后血清胆红素水平高于对照组(64±30μmol/Lvs20±4μmol/L,P<0.05),48h达高峰(275±31μmol/L),96h明显降低(95±17μmol/L),均高于对照组(P<0.05)。注射抗血清后18h,实验组红细胞降至(4.58±0.32)×1012/L,低于对照组[(5.09±0.44)×1012/L](P<0.05);24h实验组红细胞[(4.21±0.24)×1012/L]和HB(87±3g)进一步降低,低于对照组[(5.11±0.39)×1012/L,97±6g](P<0.05);二组间的红细胞、血红蛋白差异在36~48h达高峰。结论 新生猪溶血性黄疸模型较好地模拟了人类溶血性黄疸的病理过程,为更进一步研究新生儿溶血病提供了良好的生物物质基础。
关键词: 新生儿溶血病     高胆红素血症     动物模型         
Establishment and validation of a neonatal pig model of hemolytic jaundice
LI Yong-Fu1, MA Yue-Lan1, NIE Ling1, CHEN Shuan1, JIN Mei-Fang2, WANG San-Lan1     
Department of Neonatology, Suzhou Municipal Hospital, Suzhou, Jiangsu 215002, China
Abstract: Objective To establish a neonatal pig model of hemolytic jaundice. Methods Twelve sevenday-old purebred Yorkshire pigs were randomly divided into an experimental group and a control group (n=6 each). Immunization of New Zealand white rabbits was used to prepare rabbit anti-porcine red blood cell antibodies, and rabbit anti-porcine red blood cell serum was separated. The neonatal pigs in the experimental group were given an intravenous injection of rabbit anti-porcine red blood cell serum (5 mL), and those in the control group were given an intravenous injection of normal saline (5 mL). Venous blood samples were collected every 6 hours for routine blood test and liver function evaluation. Results The experimental group had a significantly higher serum bilirubin level than the control group at 18 hours after the injection of rabbit anti-porcine red blood cell serum (64±30 μmol/L vs 20±4 μmol/L; P<0.05). In the experimental group, the serum bilirubin level reached the peak at 48 hours (275±31 μmol/L), and decreased significantly at 96 hours after the injection (95±17 μmol/L), but all significantly higher than that in the control group (P<0.05). At 18 hours after the injection, the experimental group had a significantly lower red blood cell (RBC) count than the control group [(4.58±0.32)×1012/L vs (5.09±0.44)×1012/L; P<0.05]; at 24 hours, the experimental group showed further reductions in RBC count and hemoglobin level and had significantly lower RBC count and hemoglobin level than the control group [RBC: (4.21±0.24)×1012/L vs (5.11±0.39)×1012/L, P<0.05; hemoglobin: 87±3 g vs 97±6 g, P<0.05]. The differences in RBC count and hemoglobin level between the two groups were largest at 36-48 hours. Conclusions The neonatal pig model of hemolytic jaundice simulates the pathological process of human hemolytic jaundice well and provides good biological and material bases for further investigation of neonatal hemolysis.
Key words: Neonatal hemolysis     Hyperbilirubinemia     Animal model     Pigs    

新生儿高胆红素血症是新生儿最常见的疾病,发病率近年有上升趋势,大约60%的足月儿和80%的早产儿在生后一周可出现黄疸,母乳喂养的婴儿在生后一个月时仍然可能存在黄疸[1]。而造成高胆红素血症的原因中新生儿血型不合溶血病(hemolytic disease of the newborn,HDN)占28%~30%[2]。新生儿血型不合溶血病主要因母婴血型不合引起,包括ABO血型和 Rh血型以及其他血型不合[3]。溶血可发生在胎儿期和新生儿早期,严重者可引起胎儿死亡,发生血型不合者出生后黄疸迅速加深[4]。因胆红素对神经系统具有毒性作用[5],可引起不同程度的脑损伤,严重者可引起胆红素性脑病,造成死亡或伤残,给家庭和社会造成极大的痛苦和经济负担。

为更加深入地研究HDN的病理生理改变以及治疗策略,制作相关疾病模型模拟病理生理过程是一种有效的方法。但目前广泛应用于黄疸研究的大多是体外细胞模型[6],动物模型多是采用注射四氯化碳、酒精、对乙酰氨基酚等造成肝细胞坏死形成黄疸[7, 8, 9, 10, 11],或者结扎/堵塞胆总管制成梗阻性黄疸模型[12],更有甚者直接采用胆红素静脉注射来进行研究[13]。大部分都是围绕肝细胞性或者梗阻性黄疸来进行,并且都是针对成年人的疾病模型。这些模型和方法均不能够体现HDN和新生儿黄疸的真正病理生理特点。

有鉴于此,我们通过制备和注射兔抗猪红细胞血清引发新生猪溶血、高胆红素血症。经检索Elsevier Science Direct、Ovid、中国知网、万方数据等数据库,证实这是国内外首次采用免疫学方法制备新生猪溶血性黄疸模型、模拟溶血性黄疸的病理生理过程,为更进一步研究HDN提供良好的生物物质基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物

7日龄纯种大约克白猪12只,雌雄不限,体重2 600~3 760 g,由苏州市太仓国家级种猪场提供(YY-TCZZC-14),随机分成实验组和对照组,每组6只。成年新西兰大白兔,体重2 650 g,由苏州大学动物中心提供,用于制备抗血清。

1.2 实验设备及试剂

台式低温高速离心机(Labofuge 400R,德国Heraeus公司),TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂),超低温冰箱(-60℃日本SANYO公司),移液器(Eppendorf公司)。ACD全血保存液,由苏州市中心血站提供。

1.3 实验方法

新生猪红细胞抗原制备:通过股静脉采取15 mL猪全血置于ACD全血保存液中,4℃冰箱保存。免疫前取适量抗凝血于离心管中,200转/min离心10 min,弃去上清,加入约8倍的无菌生理盐水悬起红细胞,2 000转/min离心10 min,吸去上清液。连续洗涤3次后制成终浓度为2%~5%的红细胞悬液,检查无溶血现象后即可用于免疫。

兔抗猪红细胞血清的制备:通过兔耳缘静脉注射制备的猪红细胞悬液,第1天0.5 mL,以后逐日递增0.5 mL,第5天达2.5 mL,共5次。第13天从兔的耳静脉或心脏采血,分离血清,作免疫溶血试验,滴定抗血清,效价达到1 : 16以上为合格。达到要求后在无菌条件下从心脏采集全部血液,4 000转/min离心20 min,分离血清。将抗血清小量分装,-60℃冻存。

新生猪溶血病模型的制备和验证:实验组新生猪静脉注射制备的兔抗猪红细胞血清5 mL,观察皮肤颜色变化,并每6 h采静脉血送检血常规及肝功能,以验证体内红细胞及胆红素的变化。对照组予以静脉注射5 mL生理盐水,常规喂养,与实验组在相同时间点采血送检血常规及肝功能。

1.4 统计学分析

采用SAS 9.3统计软件进行分析处理。所有数据用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验组在注射兔抗猪红细胞血清约8 h后出现肉眼可见黄疸、尿色变黄,18 h起血清胆红素水平高于对照组(64±30 μmol/L vs 20±4 μmol/L),差异有统计学意义(P<0.05);48 h达到高峰(275±31 μmol/L),72 h胆红素逐渐下降(231±20 μmol/ L),96 h明显降低(95±17 μmol/ L),均高于对照组(P<0.05)。整个过程中对照组未出现肉眼黄疸。见表 1

表 1 各组不同时间点胆红素水平

注射抗血清后18 h实验组红细胞降至(4.6±0.3)×1012/L,低于对照组[(5.1±0.4)×1012/L],差异有统计学意义(P<0.05);但两组间血红蛋白差异无统计学意义(93±3 g vs99±6 g),P>0.05。24 h实验组RBC [(4.21±0.24)×1012/L]和HB(87±3 g)进一步降低,低于对照组[(5.1±0.4)×1012/L,97±6 g] ,P<0.05;二组间的红细胞、血红蛋白差异在36~48 h达高峰。见表 2~3

表 2 各组不同时间点红细胞水平(n=6,x±s,×1012/L)

表 3 各组不同时间点血红蛋白水平(n=6,x±s,g/L)
3 讨论

新生儿溶血病是由于母子血型不合所致。ABO-HDN常发生在第一胎的新生儿,Rh-HDN多发生在第二胎或第二胎以后的新生儿。孕妇与胎儿依靠胎盘之间绒毛膜的合体细胞层分隔,当分隔层有小的渗漏时,胎儿红细胞就会由胎盘直接进入并刺激母体,产生相应的血型抗体。该抗体再由胎盘进入到胎儿体中,从而引起胎儿或新生儿体内出现特异性抗原抗体反应,使红细胞致敏,在单核-吞噬细胞系统内破坏而溶血[14, 15]

在自然界中,猪、羊、牛等偶蹄类哺乳动物也会发生溶血病[16]。根据文献,7日龄猪处于新生期[17],体重约2.5~4 kg,与人类足月新生儿接近;且新生猪来源易得,品系稳定,故选用7日龄新生猪作为模型的制作载体。根据HDN的发病机制,我们采用免疫学方法,通过给成年新西兰大白兔注射提纯的猪红细胞刺激兔的免疫系统,产生兔抗猪红细胞抗体。分离出含大量兔抗猪红细胞抗体的血清,注射至新生猪体内,引发抗原抗体反应,造成新生猪溶血和黄疸。为尽量减少种属差异,我们在分离猪红细胞时严格进行洗涤,制备出抗血清后也尽可能分离纯化。根据前期预实验结果,发现5 mL兔抗猪红细胞血清即可引起明显的溶血反应,但又不至于因溶血过重死亡。

结果显示,注射抗血清后,新生猪8 h开始出现肉眼黄疸,48 h黄疸达高峰;由于猪的胆红素处理能力比较强大[18],体内胆红素水平在72 h即开始降低,至96 h已降至高峰值的约1/3。故我们建议,应用本模型进行研究时以注射抗血清后48 h作为窗口期为宜。随着溶血的发生,实验组新生猪的红细胞以及血红蛋白在18 h就有降低,36~48 h降低最为明显。本实验结果提示,新生猪静脉注射兔抗猪红细胞血清后发生了黄疸和贫血,与人类HDN的病理过程相似,符合新生儿溶血病的特点,是一个稳定可靠的HDN动物模型。

目前临床上对于新生儿溶血病的治疗主要采取光照疗法、静脉注射丙种球蛋白以及换血治疗等。光疗需通过胆红素的光异构作用才能将胆红素从胆汁和尿液排出,起效慢,对于重症黄疸疗效不佳,还可能出现青铜症、DNA损伤等副作用;免疫球蛋白只能结合血中游离抗体,对于已致敏的红细胞无效,且不能直接降低血清中胆红素水平;而换血治疗操作复杂,受血源供给限制,还可出现感染、心力衰竭、心跳骤停、坏死性小肠结肠炎及肠穿孔等并发症[19]。近来有报道采用血液灌流等手段治疗新生儿溶血病,但是也存在灌流后血小板减少、血清Ca2+降低等副作用[20]。因此,仍需探寻新生儿溶血病得更好的治疗方法,而本模型较好地模拟了溶血性黄疸的病理生理过程,为更进一步研究HDN及探索新的治疗手段提供了良好的生物物质基础。

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