新生儿高胆红素血症是新生儿最常见的疾病，发病率近年有上升趋势，大约60%的足月儿和80%的早产儿在生后一周可出现黄疸，母乳喂养的婴儿在生后一个月时仍然可能存在黄疸^[1]。而造成高胆红素血症的原因中新生儿血型不合溶血病（hemolytic disease of the newborn,HDN）占28%~30%^[2]。新生儿血型不合溶血病主要因母婴血型不合引起，包括ABO血型和 Rh血型以及其他血型不合^[3]。溶血可发生在胎儿期和新生儿早期，严重者可引起胎儿死亡，发生血型不合者出生后黄疸迅速加深^[4]。因胆红素对神经系统具有毒性作用^[5]，可引起不同程度的脑损伤，严重者可引起胆红素性脑病，造成死亡或伤残，给家庭和社会造成极大的痛苦和经济负担。

为更加深入地研究HDN的病理生理改变以及治疗策略，制作相关疾病模型模拟病理生理过程是一种有效的方法。但目前广泛应用于黄疸研究的大多是体外细胞模型^[6]，动物模型多是采用注射四氯化碳、酒精、对乙酰氨基酚等造成肝细胞坏死形成黄疸^{[7, 8, 9, 10, 11]}，或者结扎/堵塞胆总管制成梗阻性黄疸模型^[12]，更有甚者直接采用胆红素静脉注射来进行研究^[13]。大部分都是围绕肝细胞性或者梗阻性黄疸来进行，并且都是针对成年人的疾病模型。这些模型和方法均不能够体现HDN和新生儿黄疸的真正病理生理特点。

有鉴于此，我们通过制备和注射兔抗猪红细胞血清引发新生猪溶血、高胆红素血症。经检索Elsevier Science Direct、Ovid、中国知网、万方数据等数据库，证实这是国内外首次采用免疫学方法制备新生猪溶血性黄疸模型、模拟溶血性黄疸的病理生理过程，为更进一步研究HDN提供良好的生物物质基础。

7日龄纯种大约克白猪12只，雌雄不限，体重2 600~3 760 g，由苏州市太仓国家级种猪场提供（YY-TCZZC-14），随机分成实验组和对照组，每组6只。成年新西兰大白兔，体重2 650 g，由苏州大学动物中心提供，用于制备抗血清。

台式低温高速离心机（Labofuge 400R，德国Heraeus公司），TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂），超低温冰箱（-60℃日本SANYO公司），移液器（Eppendorf公司）。ACD全血保存液，由苏州市中心血站提供。

新生猪红细胞抗原制备：通过股静脉采取15 mL猪全血置于ACD全血保存液中，4℃冰箱保存。免疫前取适量抗凝血于离心管中，200转/min离心10 min，弃去上清，加入约8倍的无菌生理盐水悬起红细胞，2 000转/min离心10 min，吸去上清液。连续洗涤3次后制成终浓度为2%~5%的红细胞悬液，检查无溶血现象后即可用于免疫。

兔抗猪红细胞血清的制备：通过兔耳缘静脉注射制备的猪红细胞悬液，第1天0.5 mL，以后逐日递增0.5 mL，第5天达2.5 mL，共5次。第13天从兔的耳静脉或心脏采血，分离血清，作免疫溶血试验，滴定抗血清，效价达到1 : 16以上为合格。达到要求后在无菌条件下从心脏采集全部血液，4 000转/min离心20 min，分离血清。将抗血清小量分装，-60℃冻存。

新生猪溶血病模型的制备和验证：实验组新生猪静脉注射制备的兔抗猪红细胞血清5 mL，观察皮肤颜色变化，并每6 h采静脉血送检血常规及肝功能，以验证体内红细胞及胆红素的变化。对照组予以静脉注射5 mL生理盐水，常规喂养，与实验组在相同时间点采血送检血常规及肝功能。

采用SAS 9.3统计软件进行分析处理。所有数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

实验组在注射兔抗猪红细胞血清约8 h后出现肉眼可见黄疸、尿色变黄，18 h起血清胆红素水平高于对照组（64±30 μmol/L vs 20±4 μmol/L），差异有统计学意义（P<0.05）；48 h达到高峰（275±31 μmol/L），72 h胆红素逐渐下降（231±20 μmol/ L），96 h明显降低（95±17 μmol/ L），均高于对照组（P<0.05）。整个过程中对照组未出现肉眼黄疸。见表 1

表 1

表 1 各组不同时间点胆红素水平（n=6，x±s，μmol/L）

表 1 各组不同时间点胆红素水平

注射抗血清后18 h实验组红细胞降至（4.6±0.3）×1012/L，低于对照组[（5.1±0.4）×10¹²/L]，差异有统计学意义（P<0.05）；但两组间血红蛋白差异无统计学意义（93±3 g vs99±6 g），P>0.05。24 h实验组RBC [（4.21±0.24）×10¹²/L]和HB（87±3 g）进一步降低，低于对照组[（5.1±0.4）×10¹²/L，97±6 g] ，P<0.05；二组间的红细胞、血红蛋白差异在36~48 h达高峰。见表 2~3。

表 2

表 2 各组不同时间点红细胞水平（n=6，x±s，×1012/L）

表 2 各组不同时间点红细胞水平（n=6，x±s，×1012/L）

表 3

表 3 各组不同时间点血红蛋白水平（n=6，x±s，g/L）

表 3 各组不同时间点血红蛋白水平（n=6，x±s，g/L）

新生儿溶血病是由于母子血型不合所致。ABO-HDN常发生在第一胎的新生儿，Rh-HDN多发生在第二胎或第二胎以后的新生儿。孕妇与胎儿依靠胎盘之间绒毛膜的合体细胞层分隔，当分隔层有小的渗漏时，胎儿红细胞就会由胎盘直接进入并刺激母体，产生相应的血型抗体。该抗体再由胎盘进入到胎儿体中，从而引起胎儿或新生儿体内出现特异性抗原抗体反应，使红细胞致敏，在单核-吞噬细胞系统内破坏而溶血^{[14, 15]}。

在自然界中，猪、羊、牛等偶蹄类哺乳动物也会发生溶血病^[16]。根据文献，7日龄猪处于新生期^[17]，体重约2.5~4 kg，与人类足月新生儿接近；且新生猪来源易得，品系稳定，故选用7日龄新生猪作为模型的制作载体。根据HDN的发病机制，我们采用免疫学方法，通过给成年新西兰大白兔注射提纯的猪红细胞刺激兔的免疫系统，产生兔抗猪红细胞抗体。分离出含大量兔抗猪红细胞抗体的血清，注射至新生猪体内，引发抗原抗体反应，造成新生猪溶血和黄疸。为尽量减少种属差异，我们在分离猪红细胞时严格进行洗涤，制备出抗血清后也尽可能分离纯化。根据前期预实验结果，发现5 mL兔抗猪红细胞血清即可引起明显的溶血反应，但又不至于因溶血过重死亡。

结果显示，注射抗血清后，新生猪8 h开始出现肉眼黄疸，48 h黄疸达高峰；由于猪的胆红素处理能力比较强大^[18]，体内胆红素水平在72 h即开始降低，至96 h已降至高峰值的约1/3。故我们建议，应用本模型进行研究时以注射抗血清后48 h作为窗口期为宜。随着溶血的发生，实验组新生猪的红细胞以及血红蛋白在18 h就有降低，36~48 h降低最为明显。本实验结果提示，新生猪静脉注射兔抗猪红细胞血清后发生了黄疸和贫血，与人类HDN的病理过程相似，符合新生儿溶血病的特点，是一个稳定可靠的HDN动物模型。

目前临床上对于新生儿溶血病的治疗主要采取光照疗法、静脉注射丙种球蛋白以及换血治疗等。光疗需通过胆红素的光异构作用才能将胆红素从胆汁和尿液排出，起效慢，对于重症黄疸疗效不佳，还可能出现青铜症、DNA损伤等副作用；免疫球蛋白只能结合血中游离抗体，对于已致敏的红细胞无效，且不能直接降低血清中胆红素水平；而换血治疗操作复杂，受血源供给限制，还可出现感染、心力衰竭、心跳骤停、坏死性小肠结肠炎及肠穿孔等并发症^[19]。近来有报道采用血液灌流等手段治疗新生儿溶血病，但是也存在灌流后血小板减少、血清Ca²⁺降低等副作用^[20]。因此，仍需探寻新生儿溶血病得更好的治疗方法，而本模型较好地模拟了溶血性黄疸的病理生理过程，为更进一步研究HDN及探索新的治疗手段提供了良好的生物物质基础。